染色質(zhì)水相法分離實(shí)驗(yàn)操作步驟

染色質(zhì)水相法分離實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)材料 ：細(xì)胞

試劑、試劑盒：水相裂解緩沖液        

儀器、耗材：離心機(jī)

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 收獲細(xì)胞。

對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（500 ml 培養(yǎng)基），室溫 1500 g 離心 5 分鐘收獲細(xì)胞。在室溫用聚胺緩沖液清洗三次所得到的沉淀，1500 g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。

聚胺緩沖液：

15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

0.2 mmol/L 精胺

0.5 mmol/L 精咪

2 mmol/L EDTA

80 mmoI/L KCl

0.1 mmol/L PMSF（臨用前從用 100% 乙醇制備的 1 mmol/L 的貯存液中加入）

像聚胺法的第 1、2 步中講的那樣誘導(dǎo)懸浮或單層培養(yǎng)細(xì)胞的中期阻遏狀態(tài)。

2. 細(xì)胞在 4℃，1000 g 離心 10 分鐘然后重懸浮，典型的制備量為 10 ml 新鮮培養(yǎng)基含 108 個(gè)細(xì)胞。

3. 將濃的細(xì)胞懸液在冰上放置至少 30 分鐘冷卻以幫助有絲分裂復(fù)合物的完全解離。

4. 4℃ 1000 r/min 離心 10 分鐘沉淀細(xì)胞。

5. 沉淀用 10 ml 75 mmol/L 的 KCI 重懸浮，4℃ 孵育 20 分鐘進(jìn)行低滲溶脹。

6. 4℃ 1000 r/min 離心溶脹細(xì)胞。

7. 將細(xì)胞重懸浮于 10 ml 的水相裂解緩沖液中，溫和攬拌，冰上放置 5 分鐘。

水相裂解緩沖液：

10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

120 mmol/L KCl

20 mmol/L NaCl

0.1 % Triton X-100

含 2 mmol/L CaCl2 的 0.1 mmol/L PMSF

8. 將懸液溫和地反復(fù)通過一 25 號皮下注射針頭大約 10 次或用 Dounce 勻漿器破碎法使細(xì)胞完全裂解（避免產(chǎn)生氣泡）。

9. 將破碎的細(xì)胞在 4℃ 400 g 離心 3 分鐘去除細(xì)胞核，上清移至一干凈的離心管中。

10. 4℃ 3000 g 離心上清 15 分鐘以濃縮染色體。