ELISA實(shí)驗(yàn)原理及方法

      酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。它是應(yīng)用最多的一種免疫酶技術(shù)。ELISA試劑盒（ELISAKits）已成為藥物和植物病理學(xué)研究中的常用診斷工具，是檢測組織提取液、血清和細(xì)胞培養(yǎng)液中目標(biāo)抗體/抗原的理想工具，也是重要的質(zhì)量控制手段。

一、主要實(shí)驗(yàn)原理：

包被：抗原或者抗體能以物理性吸附于固相載體表面，原因是蛋白質(zhì)和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗體反應(yīng)等免疫活性；

標(biāo)記：抗原或者抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點(diǎn)；

顯色：酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或者抗體結(jié)合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計(jì)算抗原或者抗體的相對含量。

二、ELISA實(shí)驗(yàn)的方法：

1、雙抗夾心法

雙抗夾心法常用于抗原、蛋白等檢測。因?yàn)榘袠?biāo)夾在包被在孔上的捕獲抗體和檢測抗體之間，故稱之為雙抗夾心法。一般分為：雙抗體夾心法和雙抗原夾心法，前者用于檢測抗原，后者用于檢測抗體。與間接法相比，具有優(yōu)越的靈敏度和特異性。主要針對至少2個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原。

臨床上具有2個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原有很多，比較常見有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。檢測步驟為：先將純化的相應(yīng)抗體包被在固相載體上，再加入待測樣品，若其中含有待測抗原就會(huì)與固相抗體結(jié)合，洗掉雜質(zhì)后，再加入酶標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗掉多余的酶標(biāo)抗體后，加入底物顯色，顯色與否以及顏色的深淺就代表了待測抗原是否存在以及相對含量。

2、競爭法

競爭法ELISA一般用于檢測小分子抗原。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，無法同時(shí)與兩種抗體結(jié)合因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，故可以采用競爭法模式。一般常用于小分子、lgA、lgG、lgM等檢測。該技術(shù)測抗原的原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。

3、間接法

是檢測抗體最常用也最簡單的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。間接法具有一些特點(diǎn)：1.酶標(biāo)記抗抗體可選擇性檢測抗體的亞型，可用于鑒別感染時(shí)期；2.酶標(biāo)抗抗體檢測抗體特異性不高，容易產(chǎn)生假陽性。臨床上常用該方法檢測抗HCV抗體、抗HEV抗體、抗CMV抗體、抗HSV抗體、抗沙眼衣原體抗體等。