ELISA實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

   ELISA實(shí)驗(yàn)操作人員經(jīng)常會(huì)遇到自己的檢測(cè)數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差別較大，甚至相反，或與預(yù)期不一致的情況，也常常為此感到困惑。針對(duì)此現(xiàn)象現(xiàn)給您答疑解惑，引起ELISA測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)不一致的原因主要有三點(diǎn)：標(biāo)本因素、試劑因素、操作因素。

現(xiàn)就操作因素做詳細(xì)說明：

1、嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2、檢測(cè)前應(yīng)將試劑放置室溫平衡半小時(shí)，洗滌液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，同時(shí)觀察濃縮洗滌液中有無結(jié)晶，若有結(jié)晶應(yīng)放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB時(shí)應(yīng)注意有無顏色變化，若已顯色則可能過期或變質(zhì)，也不可使用。

3、加樣后及時(shí)放入孵育箱。標(biāo)本較多時(shí)，要分批操作。按照說明書步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間，防止孵育時(shí)間人為延長(zhǎng)，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。

4、封板溫育時(shí)，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，不會(huì)引起孔間的污染，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板“的出現(xiàn)。

5、應(yīng)保證酶標(biāo)版清潔，整個(gè)操作過程中保證酶標(biāo)版不接觸次氯酸。

6、加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)版表面輕拭吸干。

7、合理安排檢測(cè)量，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時(shí)間長(zhǎng)。

8、用洗板機(jī)洗板時(shí)，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完版后好在吸水紙（選擇干凈，無塵的吸水材料）上輕輕拍干。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結(jié)晶，將堵塞洗板機(jī)針孔，造成全堵或半堵狀態(tài)，以致使未結(jié)合的酶標(biāo)記物不能完全洗脫，而使后底物顯色時(shí)加深，造成假陽性或花板。廢液瓶裝滿后應(yīng)及時(shí)清空，以防止廢液回流對(duì)管道的污染，而使洗滌不徹底，造成花板。洗板結(jié)束后應(yīng)用蒸餾水徹底清洗管道，以防止廢液在管道中的殘留。洗滌次數(shù)及加液量不可完全按照試劑說明書設(shè)定，應(yīng)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況來設(shè)定，開展新項(xiàng)目前，應(yīng)做好驗(yàn)證工作，根據(jù)洗滌的效果來決定洗滌的次數(shù)和加液量。同時(shí)應(yīng)根據(jù)儀器維護(hù)保養(yǎng)程序，定期對(duì)洗板機(jī)進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。

9、手動(dòng)洗板時(shí)，加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應(yīng)新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無粉塵和碎屑的優(yōu)質(zhì)吸水紙。需要用力拍板，使孔內(nèi)沒有可見液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標(biāo)板拍干后立即做后續(xù)的加液。

10、加樣量的準(zhǔn)確與否，直接影響抗原抗體結(jié)合物的濃度，直至后顯色的深淺。吸嘴插入血清不可太深，若插入太深，吸嘴外壁可能粘連太多血清，輕微的抖動(dòng)動(dòng)即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中，造成交叉污染。加樣時(shí)應(yīng)盡可能的垂直加樣，并加在包被孔的底部，不可加在孔的上部。標(biāo)本量大時(shí)，可考慮使用排槍加試劑，可提高速度，但使用排槍時(shí)應(yīng)注意吸嘴一定要裝好，不可松動(dòng)，否則會(huì)影響加樣量的準(zhǔn)確度。加樣時(shí)保持顯色劑不外流，顯色劑應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。

11、加樣時(shí)間間隔對(duì)結(jié)果也有一定的影響，在競(jìng)爭(zhēng)抑制法試驗(yàn)中，理論上應(yīng)該是標(biāo)本與酶標(biāo)抗體混合后同時(shí)加入反應(yīng)孔，若標(biāo)本先于酶標(biāo)抗體加入反應(yīng)孔，則標(biāo)本會(huì)先與包被抗體進(jìn)行反應(yīng)，造成特異性假陽性。若是有干擾物質(zhì)存在時(shí)表現(xiàn)明顯，在公平條件下，干擾物質(zhì)與包被抗體的結(jié)合能力會(huì)低于標(biāo)本，而在非公平條件下，干擾物質(zhì)會(huì)優(yōu)先與包被抗體進(jìn)行結(jié)合，出現(xiàn)假陽性。做HBcAb項(xiàng)目時(shí)，若標(biāo)本與酶加樣時(shí)間間隔太長(zhǎng)，會(huì)引起吸光度的趨勢(shì)性變化，會(huì)造成吸光度的降低。特別是針對(duì)臨界值標(biāo)本，出現(xiàn)假陽性。

12、洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。洗液需要稀釋時(shí)，應(yīng)按要求稀釋。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的超純水或雙蒸水，電導(dǎo)率小于1.5μS/cm,洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其溶解后配制。配制后要測(cè)定其pH值，使其范圍在7.2-7.4之間。