PCR擴增產物分析與產物出現(xiàn)雜帶解決方案參考

       PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。

凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。

酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物堿基突變的有效方法。

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記后做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產物特異性鑒定及變異分析。

核酸序列分析：是檢測PCR產物特異性的zui 可靠方法。

PCR擴增產物出現(xiàn)雜帶可能的原因和對應解決方案如下：

1.引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

2.循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù).3.酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。

4.退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的 pcr 擴增。以 2 度為梯度設計梯度 PCR 反應優(yōu)化退火溫度。

5.樣品處理不當。

6.Mg2+ 濃度偏高，因適當調整 Mg2+ 使用濃度。

7.若為 PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。推薦使用engreen的PCR試劑盒，添加改良的DNA聚合酶，大大提高擴增產物的特異性和保真性。