實時熒光定量（RT-PCR）PCR反應技術提升技巧方法

PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法，即通過試管中進行的DNA復制反應，使極少量的基因組DNA或RNA樣品中特定基因片段在短短幾小時內(nèi)擴增上百萬倍。簡單說，就是我們在體外模仿體內(nèi)DNA復制的過程，混合DNA模板、合適的引物、足夠的4種dNTP、耐熱DNA聚合酶以及適宜的體系后，在一定溫度和時間條件下，進行的DNA擴增。

PCR有很多種，其中RT-PCR(實時熒光定量)原理：基于PCR反應的技術提升與延伸，有染色法和熒光探針法。實時熒光定量（RT-PCR）PCR反應技術提升技巧方法有以下幾種：

1、分離高質(zhì)量RNA
成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA應保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的大值。

2、促進逆轉(zhuǎn)錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結(jié)構(gòu)，多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。

3、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。

4、使用無RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶
在逆轉(zhuǎn)錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。

5、RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，在cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。

6、小量RNA檢測方法的提高
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量?？梢栽诩尤隩rizol的同時加入無RNase的糖元。對于小于50mg的組織106個培養(yǎng)細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應中加入乙?；疊SA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉(zhuǎn)錄反應時加入BSA或RNase抑制劑。

7、減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染，可以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的DNA水解。為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產(chǎn)物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于污染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。