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PCP反應效率低值調整操作
反應效率視為實時熒光定量PCR 分析設計和優(yōu)化的關鍵因素。利用標準曲線(通過對目標模板進行連續(xù)梯度稀釋獲得) 獲取效率值。該效率值可作為總反應的“健康”標志。低效率與高效率所造成的影響有所不同。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠。理想的反應效率為100%，但反應效率在90–110% 范圍內都是可以接受的。
確定某個特定的分析效率是否低下的方法是稀釋模板生成標準曲線(模板稀釋的范圍應涵蓋所有未知樣本)，然后查看該范圍內的效率。它應盡可能接近100%。熔解曲線出現(xiàn)多個峰或凝膠顯示多種產物意味著反應源物質之間存在競爭作用，這必將對反應效率產生影響。一旦確定反應被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調整到理想范圍內。
1、對于抑制作用，可去除模板濃度zui高的反應孔并重新分析標準曲線。如果效率重新回到110% 以下，則分析良好。
2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應延長干燥時間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。
3、通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。此過程有時相對簡單，但在某些情況下，隨著分析復雜度的提高，優(yōu)化過程可能十分耗時費力。
4、擴增單個產物時，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應效率，但當出現(xiàn)競爭作用時，則應降低鎂的濃度。
5、在某些情況下(主要是多重反應中)，必須采用引物和探針優(yōu)化基質。此時，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度，有時甚至還需檢測探針比值，以找出分析的理想濃度組合。引物濃度介于100至600nM之間，而探針濃度則在100nM至400nM 之間。
6、根據引物的Tm 值，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當，且引物設計時使之有相似的Tm 值。
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