逆轉錄PCR技術原理及反應體系介紹

        PCR反應需要以雙鏈DNA作為模板，因此最初的PCR反應用于檢測目標樣本的基因組中是否存在特定的目的片段，但是這種以基因組DNA為模板的PCR反應無法檢測目的基因是否在樣本中表達，此外由于真核生物的基因中存在內含子，直接通過基因組DNA進行PCR也很難確定樣本中是否存在目的基因，針對這一問題，發(fā)展出了逆轉錄PCR的技術。

技術原理：

逆轉錄PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR) 是以mRNA為模板，在逆轉錄酶作用下合成cDNA，之后再進行PCR的過程。

mRNA逆轉錄合成cDNA的過程分為兩步：

在特定引物的介導下，通過逆轉錄酶的催化下以mRNA為模版合成互補的cDNA第一鏈；

升高溫度使cDNA第一鏈與mRNA解離，然后降溫，使其與另一引物退火結合，并由DNA聚合酶催化延伸生成cDNA第二鏈。

RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品的分析成為可能，該技術主要用于分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。

逆轉錄反應體系：

1. RNA模板

通常20μL的逆轉錄體系，加入總RNA 1μg，如果總RNA加入過多，會導致逆轉錄不充分。

2. 引物

常用的有隨機引物和Oligo(dT)引物：

隨機引物會將所有RNA分子均進行逆轉錄，此時得到的cDNA大部分來源于rRNA，主要在部分mRNA含有逆轉錄酶終止序列而難以得到其全序列時使用；

Oligo(dT)與真核生物mRNA的Poly(A)區(qū)域匹配，可以特異性的對mRNA進行逆轉錄。

3. 逆轉錄酶
逆轉錄過程涉及以RNA為模板合成DNA和以DNA為模板合成互補鏈的兩個過程，目前市場上的逆轉錄酶都同時具有這些功能，因此只需在反應體系中加入逆轉錄酶即可，而不需額外加入DNA聚合酶。

4. 4種dNTPs