資訊推送:ELISA試驗(yàn)洗板機(jī)洗板關(guān)鍵點(diǎn)

　優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號(hào)，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號(hào)。不充分的洗滌會(huì)導(dǎo)致差異和高背景，從而帶來(lái)不理想的結(jié)果。在做ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，洗板操作合乎要求，能得到正確、可靠的結(jié)果。

ELISA試驗(yàn)過(guò)程中洗板機(jī)洗板人為因素少，速度快，條件恒定，但是使用洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)注意以下三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。
1、洗滌參數(shù)
主要的參數(shù)是洗滌量。自動(dòng)洗板機(jī)會(huì)分配洗滌液。如果你之前遭遇過(guò)高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會(huì)讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。
ELISA試劑盒的使用手冊(cè)中列出包被量。我們建議使用350µl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個(gè)反應(yīng)孔的壁。一般來(lái)說(shuō)，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
2、洗滌次數(shù)
影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度，使其難以測(cè)定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過(guò)，一般而言，包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對(duì)于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過(guò)量的洗滌液。一般來(lái)說(shuō)，96孔板的每個(gè)孔能容納330至460 µl。不過(guò)，有些自動(dòng)化洗板機(jī)可設(shè)置程序，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個(gè)量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢?其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是在分液的同時(shí)打開(kāi)吸液功能。，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會(huì)溢出到其他孔中。

3、抽 吸
還有一些參數(shù)會(huì)影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整，以降低背景(殘留量)和差異。 　殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會(huì)增加背景信號(hào)。殘留量越小，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。

　　吸液高度會(huì)明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會(huì)讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會(huì)使吸液效率降低，殘留量增加。

　　目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭中的吸頭可在洗滌過(guò)程中自由上下移動(dòng)，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來(lái)更為復(fù)雜，因?yàn)槟阈枰浅Ｗ屑?xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實(shí)驗(yàn)室使用幾種不同的板，那可能會(huì)很耗時(shí)。在使用浮動(dòng)洗頭時(shí)，吸頭會(huì)降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會(huì)下降到底部。

　　抽吸的位置也對(duì)殘留量有著重要影響;如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)(這很常見(jiàn)，因?yàn)楦?，那么抽吸的位置需要優(yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭最常見(jiàn)的默認(rèn)位置。一般來(lái)說(shuō)，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。反應(yīng)孔的形狀也會(huì)影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會(huì)比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

       ELISA實(shí)驗(yàn)洗板目的在于將特異性結(jié)合于固相上的抗原(抗體)與溫育過(guò)程中吸附的非特異性成份分離，使免疫復(fù)合物與待測(cè)抗體(抗原)呈一定比例，洗板是否合格直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明控制洗板時(shí)間及洗板次數(shù)， ELISA 檢測(cè)一般用洗滌液洗板 3 次，洗滌液應(yīng)嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行稀釋，洗液應(yīng)注滿每個(gè)微孔并注意洗液不外溢，垂直甩板避免交叉污染，防止出現(xiàn)假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果。使用洗板機(jī)洗板可一定程度上避免環(huán)境污染、提高工作效率，洗滌開(kāi)始時(shí)注意觀察每根吸液針是否一直插入孔底并吸干孔內(nèi)全部液體，嚴(yán)格按照要求設(shè)置一定的洗板時(shí)間及洗板次數(shù)。洗板過(guò)程中注意沖力大小，避免沖力過(guò)大導(dǎo)致酶結(jié)合物丟失，吸光度值偏低。洗液應(yīng)根據(jù)不同廠家的酶標(biāo)板調(diào)整注水量，注意不要溢出孔外；稀釋洗液所用的蒸餾水或去離子水酸堿度適中，使配出的洗液 pH 在 7.2~7.6 范圍內(nèi)，用非金屬容器保存，保持液體新鮮無(wú)污染、沉淀。洗板結(jié)束后將板拍干，應(yīng)垂直扣在備好的干凈的吸水紙或毛巾上，且注意每次更新干凈的吸水紙或毛巾。

洗板時(shí)注意以下問(wèn)題：
(1)、需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于 2μl；
(2)、及時(shí)更換破損吸液針，避免破壞底板包被；
(3)、針對(duì)不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板；
(4)、注意調(diào)整洗液量，洗液量過(guò)多將溢出，過(guò)少將達(dá)不到洗滌效果；
(5)、關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道；
(6)、不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。臨床操作中，工作人員由于擔(dān)心洗板次數(shù)過(guò)少達(dá)不到去除非特異性物質(zhì)的理想效果而增加洗板次數(shù)，最近研究發(fā)現(xiàn)，隨著洗板次數(shù)的增加樣本檢測(cè)的 OD 值降低，造成假陰性結(jié)果及灰區(qū)標(biāo)的漏檢。