PCR反應(yīng)的特異性解讀

        PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60°C左右)時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素：

1、引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

2、堿基配對(duì)原則；

3、Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

4、靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

PCR 反應(yīng)特異性提高的方法：　　

1. 引物的設(shè)計(jì)

　　引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度 15-30bp，GC 含量小于 60%，3’端不超過(guò)連續(xù)三個(gè) G 或 C，堿基分布錯(cuò)落有致，避免引物自身形成二聚體，設(shè)計(jì)完成之后，需進(jìn)行 BLAST 檢測(cè)，如果與其他基因不具有互補(bǔ)性，則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2. 降落 PCR

　　降落 PCR 是一種簡(jiǎn)單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR，最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以降低實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，同時(shí)又可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的步驟。引物的設(shè)計(jì)決定退火溫度，退火溫度過(guò)高會(huì)使 PCR 效率過(guò)低，過(guò)低則會(huì)使非特異擴(kuò)增過(guò)多。這雖然可以通過(guò)反復(fù)嘗試來(lái)優(yōu)化，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。降落 PCR 提供了一個(gè)較為簡(jiǎn)易的優(yōu)化方法。首先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時(shí)雖然擴(kuò)增效率低，但非特異擴(kuò)增基本沒(méi)有。隨著退火溫度的降低，非特異擴(kuò)增會(huì)逐步增多。但由于此時(shí)特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，因此會(huì)對(duì)非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率。

3. 熱啟動(dòng)擴(kuò)增

　　采用熱啟動(dòng)方法進(jìn)行擴(kuò)增，是除了設(shè)計(jì)最佳引物之外，提高 PCR 反應(yīng)特異性好的方式。在一般的 PCR 反應(yīng)中，試劑的配置需在冰上進(jìn)行，且要將 PCR 儀預(yù)熱，這種方法就類似于熱啟動(dòng)，能夠一定程度的抑制錯(cuò)配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有 DNA 鏈存在，就會(huì)擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動(dòng)的方法就是在達(dá)到變性溫度之前wan全抑制酶的活性，而zui有效的方法就是使用熱啟動(dòng) Taq 酶(或熱啟動(dòng)高保真聚合酶)去擴(kuò)增，它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心，當(dāng)溫度上升到 95℃時(shí)恢復(fù)活性，指導(dǎo)擴(kuò)增。

4. 巢式 PCR

　　采用巢式 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，在多輪擴(kuò)增結(jié)果中提高擴(kuò)增特異性和靈敏度。與普通 PCR 不同的是，它采用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，首先用第一對(duì)引物普通 PCR，然后將第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對(duì)引物(巢式引物)二次擴(kuò)增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴(kuò)增的特異性和有限靶序列的靈敏度。