逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)必看干貨

         逆轉(zhuǎn)錄 PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。逆轉(zhuǎn)錄是指以 RNA 為模板，合成與其互補(bǔ)的 cDNA 的過程。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 是將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription） 和 cDNA 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，故逆轉(zhuǎn)錄稱為 RT-PCR 或反轉(zhuǎn)錄 PCR。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 實(shí)驗(yàn)原理為：提取組織或細(xì)胞中的總 RNA，以 RNA 為模板，首先在利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再以 cDNA 鏈為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，從而獲得大量拷貝。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的出現(xiàn)使 RNA 檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量 RNA 樣品分析成為可能。

一、逆轉(zhuǎn)錄 PCR 應(yīng)用：
逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的用途廣泛，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、檢測(cè)細(xì)胞中 RNA 病毒的含量、合成 cDNA 探針、直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。如在臨床上 RT-PCR 可以用于遺傳病診斷、癌癥檢測(cè)、檢測(cè)病人標(biāo)本中的 RNA 病毒，如 HAV、HCR、HIV 等。在植物方面 RT-PCR 常用于研究環(huán)境脅迫對(duì)植物基因表達(dá)的影響，以及在特定的環(huán)境或生長(zhǎng)階段中植物體不同部位基因表達(dá)的差異性。使用 RT-PCR 檢測(cè)分析 RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：
1、理論上可以檢測(cè)幾乎任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；
2、 可以實(shí)現(xiàn)極為微量 RNA 樣品（ng 級(jí)別）的檢測(cè)；
3、 樣品耐受性好，未經(jīng)純化的粗制生物樣品也可以用于檢測(cè)；
二、模板
逆轉(zhuǎn)錄 PCR 的模板是 RNA，可以是總 RNA、mRNA 或體外轉(zhuǎn)錄的 RNA 產(chǎn)物。無論使用何種 RNA，都需確保 RNA 中無 RNA 酶和基因組 DNA 的污染。
三、RNA 提取
可以利用試劑盒從細(xì)胞（或組織）中提取得到 RNA。模板 RNA 的純度和完整性對(duì)于擴(kuò)增的結(jié)果有很大影響，從細(xì)胞中分離 RNA 應(yīng)注意盡量減少 RNA 酶的污染（RNA 酶分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性 RNA 酶外環(huán)境中也存在大量 RNA 酶），在提取 RNA 時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無 RNA 酶的環(huán)境：避免 RNA 酶污染包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制內(nèi)源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二yi酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通過 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑抑制內(nèi)源性 RNA 酶。
四、引物
用于反轉(zhuǎn)錄的引物有隨機(jī)引物、通用引物（Oligo-dT）及基因特異性引物三種。引物zui 好選擇 Oligo-dT 或基因特異性引物，隨機(jī)引物會(huì)從 RNA 的多個(gè)位點(diǎn)(包括核糖體 RNA)開始轉(zhuǎn)錄，特異性低。Oligo-dT 引物同大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA3'端的 poly(A)尾雜交，與使用隨機(jī)引物相比特異性高。但是 Oligo-dT 引物對(duì) RNA 樣品的質(zhì)量要求較高，對(duì)于從福爾馬林固定的組織中提取的劣質(zhì) RNA 不適合用 Oligo-dT 引物。
五、逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄酶是存在于 RNA 病毒體內(nèi)的依賴 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下三種活性
1. 依賴 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 為模板合成 cDNA 的第一條鏈；
2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 雜合體中的 RNA;
3. 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一條 DNA 鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈 DNA
在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時(shí)，建議選擇無 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有 RNaseH 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNaseH 活性會(huì)與聚合酶活性競(jìng)爭(zhēng) RNA 模板與 DNA 引物（或 cDNA 延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的 RNA 鏈。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作為合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的產(chǎn)量與長(zhǎng)度。
六、實(shí)驗(yàn)流程
從細(xì)胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs 的反應(yīng)體系中→退火，引物與 RNA 鏈配對(duì)→延伸，逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) cDNA 鏈變性→常規(guī) PCR 反應(yīng)流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。
七、RT-PCR“兩步法”與“一步法”
RT-PCR 的實(shí)驗(yàn)操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需構(gòu)建 cDNA 文庫（即 cDNA 合成與 PCR 反應(yīng)在同一 Buffer 及酶中進(jìn)行，一步法完成），省略了 cDNA 與 PCR 之間的過程。兩步法 RT-PCR 首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，即 RNA 反轉(zhuǎn)錄與 PCR 擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。一步法 RT-PCR 與兩步法相比快速、簡(jiǎn)便、減少了污染機(jī)會(huì)、減少了 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、減少了 PCR 反應(yīng)的錯(cuò)配率。RT-PCR 兩步法的優(yōu)勢(shì)在于存在中間產(chǎn)物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的 1/10 進(jìn)行反應(yīng)，有利于 PCR 條件的調(diào)整，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性強(qiáng)；兩步法可以在第二步 PCR 反應(yīng)體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實(shí)驗(yàn)預(yù)算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈 cDNA 合成和隨后的 PCR 反應(yīng)，容易產(chǎn)生污染問題。
八、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：
1、 RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；
2、RNA 提取完馬上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的 RNA 很容易降解； 
3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無 RNAase 環(huán)境，以避免模板 RNA 降解；
注：
  RNase 是 RNA 水解酶的統(tǒng)稱，包含 RNase A，RNase H 等，RNase A 可以水解單雙鏈 RNA，RNase H 主要水解 RNA 與 DNA 雜交雙鏈中的 RNA。