聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系條件分析

       聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)操作簡便，特異性強(qiáng)，敏感度極高，正因?yàn)槊舾卸雀撸苋菀资芷渌蛩氐挠绊?，因此要得到?zhǔn)確可靠的反應(yīng)結(jié)果，需根據(jù)不同的模板，摸索最適合的條件，配制出PCR反應(yīng)試劑。
聚合酶鏈反應(yīng)必須具備下述基本條件：
①模板核酸（DNA或RNA；
②人工合成的寡核苷酸引物；
③合適的緩沖體系；
④鎂離子；
⑤三磷酸脫氧核苷酸；
⑥耐熱DNA聚合酶，RNA反轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶抑制劑（RNasin）；
⑦ 溫度循環(huán)參數(shù)（變性、復(fù)性和延伸的溫度與時(shí)間及循環(huán)次數(shù)）。

1．模板的選擇
PCR反應(yīng)用DNA（單、雙鏈DNA）或RNA都可以作模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后才能進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。核酸標(biāo)本來源廣泛，可以從純培養(yǎng)的細(xì)胞或微生物中直接提取，也可以從臨床標(biāo)本（血、尿、便、痰、體腔積液、漱口水等）、犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本（血斑、精斑、毛發(fā)等）、病理標(biāo)本（新鮮或固定石蠟包埋標(biāo)本）以及木乃伊標(biāo)本中提取。無論標(biāo)本來源如何，待擴(kuò)增核酸都需部分純化，以使核酸樣品中不混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。雖然PCR可以僅用微量樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA），但為保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用納克級(jí)（ng）的克隆DNA、微克水平的染色體DNA或102-105拷貝的待擴(kuò)增DNA片段做起始材料。

2．引物
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及擴(kuò)增的靶序列在基因組中的位置是由引物限定的。因此，引物的選擇與合成對(duì)PCR成功與否具有決定性意義。對(duì)某一DNA片段來說，由于同源順序的存在，隨意設(shè)計(jì)的兩條引物鏈，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)多條電泳帶。因此，在引物的設(shè)計(jì)過程中要考慮引物鏈的特異性，即它們只與被檢測(cè)的DNA片斷互補(bǔ)。

(1) 、引物長度以16-30個(gè)堿基為宜，最佳20-24個(gè)bp，不會(huì)形成穩(wěn)定的復(fù)合體。

(2) 、有時(shí)引物不起作用，理由不明，可以移動(dòng)序列位置來解決。

(3) 、（G+C）%含量一般40%-60%為佳，兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似。

(4)、 兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端避免形成“引物二聚體”。如無法避免，其3’端互補(bǔ)不應(yīng)大于2個(gè)堿基。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，避免同源序列（尤其6個(gè)以上相同）。

(5)、 引物內(nèi)部避免形成次級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)卡結(jié)構(gòu)，必要時(shí)應(yīng)通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

(6) 、引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端，一是易形成引物二聚體，二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶目標(biāo)并且起始材料又不太純時(shí)容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)特異性也較好。

3．鎂離子濃度
Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量有著顯著影響。PCR中常用的體系應(yīng)Mg2+濃度為1.5mmol/L，但對(duì)不同的反應(yīng)體系應(yīng)優(yōu)化Mg2+濃度。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物產(chǎn)量減少。PCR反應(yīng)中Mg2+的加入量要比dNTP濃度高0.5-2.5mmol/L。最好對(duì)每種PCR反應(yīng)體系Mg2+量的優(yōu)化。另外，還需注意引物和模板DNA原液中是否含EDTA等螯合劑影響游離Mg2+的濃度。

4．三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）
PCR反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為50-200μmol/L，在此范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物量、特異性與合成忠實(shí)性這間的平衡最佳，dNTP濃度過低必然影響擴(kuò)增產(chǎn)量，過高則會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤摻入，其濃度不能低于10-15μmol/L。由于dNTP的量還受其他因素的影響，所以不同反應(yīng)體系中dNTP的最佳濃度不盡相同。

5、TapDNA聚合酶
在其他參數(shù)最佳時(shí)，每100μl反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNa酶。然而酶的需要量可以根據(jù)不同的模板分子或引物而變化，當(dāng)優(yōu)化一種PCR反應(yīng)體系時(shí)，最好在每100μl體積中加入0.5-5u酶的范圍內(nèi)試驗(yàn)最佳酶濃度。如酶濃度太高，會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而過低時(shí)，則擴(kuò)增產(chǎn)量太低。另外不同來源的Taq DNA酶、測(cè)定條件和單位定義的不同、生產(chǎn)廠家產(chǎn)品品質(zhì)的優(yōu)劣，這些都是使用Taq酶時(shí)需要考慮的因素。

6．溫度循環(huán)參數(shù)
變性溫度通常為94℃左右，主要取決于擴(kuò)增片段的長度和（G+C）的比例，達(dá)不到變性溫度致使變性不完全，是導(dǎo)致PCR失敗的常見原因。變性時(shí)間一般為30-60秒，時(shí)間太長不但沒有必要反而會(huì)因降低酶的活性而影響產(chǎn)量和反應(yīng)特異性。常用PCR一般為20-40個(gè)周期，隨著周期次數(shù)增加TaqDNA聚合酶活性降低，聚合時(shí)間延長，引物或單核苷酸減少等原因，會(huì)造成反應(yīng)后期容易發(fā)生錯(cuò)誤堿基摻入。所以在滿足產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少周期次數(shù)。

7．石蠟油
加入石蠟油的目的是防止反應(yīng)液蒸發(fā)，以免造成反應(yīng)體積和成分的改變，特別是當(dāng)反應(yīng)體積小或反應(yīng)條件嚴(yán)格時(shí)更應(yīng)注意。反應(yīng)中加入的石蠟油必須是高質(zhì)量的，無菌的，不能含有抑制PCR反應(yīng)中各種試劑活性的污染物，加入的體積要求不太嚴(yán)格，應(yīng)以蓋住反應(yīng)液液面為度。

8．平臺(tái)效應(yīng)
“平臺(tái)效應(yīng)”是指PCR后期循環(huán)產(chǎn)物累積趨于飽和，使原來以指數(shù)增長的速率變成平坦的曲線，同時(shí)出現(xiàn)非特異產(chǎn)物的大量增加的現(xiàn)象。下列因素可能與平臺(tái)效應(yīng)有關(guān)：

（1）dNTP或引物的消耗量。

（2）反應(yīng)物的穩(wěn)定度（dNTP或酶）

（3）最終產(chǎn)物的阻化作用（焦磷酸鹽、雙鏈DNA）。

（4）非特異產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物的競爭。

（5）產(chǎn)物在高濃度時(shí)變性不完全，影響引物的延伸。

（6）酶與PCR產(chǎn)物的結(jié)合，使酶分子減少。

合理的PCR循環(huán)參數(shù)，能最大限度地避免這些因素對(duì)產(chǎn)物擴(kuò)增的影響。