PCR反應(yīng)過程及反應(yīng)體系成份介紹

        PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR原理DNA雙鏈復(fù)制，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)高溫氫鍵斷裂。目的是在生物體外大量擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其特點(diǎn)是可以以微量的DNA為模板，快速擴(kuò)增得到大量拷貝。其基本過程，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時(shí)，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)過程：
1、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA解螺旋，高溫使兩條DNA鏈間的氫鍵斷裂。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱時(shí)間較長(zhǎng)以確保模板DNA完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來機(jī)器就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

2、退火：

將反應(yīng)溫度降低至50-65℃（通常比引物 值低3-5℃）持續(xù)20-40s，從而使引物結(jié)合于單鏈DNA上。若退火溫度過低，容易造成非特異擴(kuò)增，而退火溫度過高，引物可能根本不結(jié)合。

3、延伸：

此步驟的溫度取決于所用的DNA聚合酶。 Taq（Thermus aquaticus）聚合酶的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最佳活性溫度約為75–80°C，但通常使用的延伸溫度為72°C。 在這一步驟中，DNA聚合酶通過從反應(yīng)體系中添加的5'至3'方向的游離dNTP，從而合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。延伸所需的精確時(shí)間取決于所用的DNA聚合酶和待擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度。 傳統(tǒng)的Taq 酶估計(jì)合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr 酶（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40s、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15s。有修正功能的則會(huì)比較慢。
上述循環(huán)結(jié)束后，將進(jìn)入終延伸階段：此步驟是可選的，但要在70-74°C）（PCR中使用的大多數(shù)聚合酶最佳活性所需的溫度范圍）下進(jìn)行5-15分鐘。
4、循環(huán)：
以確保所有剩余的單鏈DNA的岡崎片段被補(bǔ)齊。
最終保持：最后一步將PCR儀反應(yīng)室無限期地冷卻至4–15°C，可用于PCR產(chǎn)物的短期保存。

PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、Taq DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、 Mg2+、靶序列（DNA模板）主要成份組成。各個(gè)組份對(duì)PCR結(jié)果至關(guān)重要。

1、 反應(yīng)緩沖液（PCR Buffer）
（1）、反應(yīng)緩沖液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃時(shí)pH為8.3-8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中，pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
（2）、反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段有利。
（3）、各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。

2、 脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）
dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。多次凍融會(huì)使dNTP降解。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。當(dāng)PCR需要較高濃度的dNTP時(shí)，應(yīng)在反應(yīng)體系中適當(dāng)增加Mg2+的濃度。
（1）dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度。
（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200 μmol/L。
（3）理論上4 種 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反應(yīng)中合成2.6 μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50 mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。

3、 Taq DNA聚合酶（Taq 酶）
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長(zhǎng)時(shí)間。
Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30 min，摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。
所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。
反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR產(chǎn)物經(jīng)酚: 抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
（3） 99-100℃加熱10 min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

4、 寡聚核苷酸引物
PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：
（1） 引物長(zhǎng)度約為16-30 bp， 太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長(zhǎng)則比較浪費(fèi)，且難以合成。
（2）引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
（3）四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。
（4）引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。
（5）在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。
（6）兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ)， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
（7）引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。
（8）引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。
（9）簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡(jiǎn)并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。
（10）一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體， 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì)， 可精確計(jì)算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計(jì)算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。

5、 Mg2+
（1）Mg2+濃度對(duì)Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實(shí)性，影響引物退火和解鏈溫度， 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。
（2）通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對(duì)于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出最適的Mg2+濃度。
（3）在PCR反應(yīng)混合物中， 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)， 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+ 濃度。

6、 靶序列（DNA模板）
（1）PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增， 模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好)。
（2）就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個(gè)拷貝，對(duì)于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA.擴(kuò)增多拷貝序列時(shí)，用量更少。
（3）靈敏的PCR可從一個(gè)細(xì)胞，一根頭發(fā)，一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DNA中分析目的序列。
（4）模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。

注意事項(xiàng)：
1.PCR應(yīng)該在沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行，最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR配制室、模板室、擴(kuò)增室，避免污染（16S）。
2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染，操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高溫高壓滅菌。5.試劑都應(yīng)該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性與平行性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用滅菌的tubes和tips，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR配制試劑應(yīng)在冰上融化，并且要瞬離并充分混勻。