抗體的特異性鑒定與選擇方法

        抗體特異性鑒定是免疫化學技術(shù)中，確?？乖?抗體反應(yīng)專一性的基礎(chǔ)。?從根本上驗證特異性，投稿國際權(quán)威期刊，常常需要準備這方面數(shù)據(jù)。
       鑒定抗體的特異性有四種基本方法：分子遺傳法、獨立抗體驗證法、正交法和標簽蛋白法。四種方法并非必須同時采用。通常，根據(jù)實驗的目的和研究設(shè)計的特點，選擇對自己的實驗來說具有說服力的1到2種即可。

1、分子遺傳法。
對于遺傳編碼清楚的蛋白質(zhì)，可采用分子遺傳學技術(shù)（基因敲除模型、CRISPR-Cas9、RNA干擾等）將該蛋白的表達水平顯著降低，然后用待檢抗體進行標記。如果得到陽性減弱或消失的結(jié)果，說明抗體標記的正是該蛋白質(zhì)。采用該方法要注意兩個問題。其一，針對基因的敲除或敲減操作不一定能馬上減少相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平。有的蛋白質(zhì)在生物樣本中可能有足量儲備，存在“緩沖池”；必須耗去這部分存量才能觀察到表達的下降。能否在允許的時間內(nèi)下調(diào)蛋白水平，是一個需要預試的問題。其二，基因及相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平下調(diào)后，抗體標記強度減弱，其實驗證了抗體和該基因產(chǎn)物的“相關(guān)性”，但嚴格說來，還有可能標記的并不是目標蛋白質(zhì)。尚存在這樣的可能：抗體標記的蛋白質(zhì)是與目標蛋白有密切相互作用的另一種蛋白。比如，目標蛋白減少后，抗體實際標記的蛋白無從錨定（比如膜蛋白），進而在標本處理過程中流失，結(jié)果免疫標記強度減弱。此時應(yīng)設(shè)計針對性的實驗來補充驗證。

2、獨立抗體驗證法。
同一目標分子，可采用針對不同抗原決定簇的抗體來標記。當需要對某種蛋白分子進行免疫標記時，如果手中已有經(jīng)過特異性鑒定合格的其他抗體，且識別的結(jié)構(gòu)位點與待檢抗體不同，那么原有抗體就可作為一個良好的陽性參照。如果待檢抗體與原有的合格抗體具有相同的標記結(jié)果，說明待檢抗體的特異性是合格的。本法應(yīng)用時須注意蛋白分子亞型之間的區(qū)別。比如，待檢抗體與原有合格抗體的識別位點在有的亞型二者都存在，而有的亞型則可能缺少其中之一。結(jié)構(gòu)變化可能引起功能和分布的差別，此時本法就不能起到鑒定作用。

3、正交法。
正交法即采用互不影響的技術(shù)對抗體標記的是否為目標分子進行鑒定的方法。比如要鑒定抗體是否能特異性標記某蛋白質(zhì)，可通過質(zhì)譜技術(shù)、色譜分離技術(shù)、針對生成該蛋白的RNA的原位雜交等，與抗體標記一道進行平行實驗。如果不同技術(shù)的檢測豐度/強度一致，說明抗體的標記具有特異性。采用該法時須注意各種技術(shù)自身的非特異性問題，避免因參照技術(shù)本身的特異性缺陷而減弱鑒定結(jié)果的說服力。

4、標簽蛋白法。
可采用FLAG、V5等親和標簽或GFP等熒光偶聯(lián)蛋白對待檢抗體進行鑒定。如果抗親和標簽的抗體標記強度或熒光信號強度與待檢抗體的標記強度一致，則說明待檢抗體具有特異性。

特異性的選擇主要需要考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、實驗方法特異性、標記物的特異性。

1、蛋白特異性
針對需要檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分：
a.重組蛋白如果不是全長表達，則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。
b.內(nèi)源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式，特殊表型的蛋白需要進行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列，查看交叉反應(yīng)的情況。
c.磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點，不同位點的磷酸化意味著可能有不同的機制存在，不宜一概而論。

2、種屬特異性
同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。
a.目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng)。需要參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息。

b.一些稀有種屬很難找到抗體，可以通過蛋白的序列比對，選擇同源序列免疫的抗體，不過一般這種情況生產(chǎn)商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴，如果可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體選擇。

3、實驗方法特異性
目前使用抗體的實驗方法有很多，不同的使用方法過程中，因為對蛋白樣品的處理方式不一樣，蛋白的含量有差異，對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。

4、標記物的特異性
一般基于實驗操作的實驗方法不會使用帶有標記的一抗，比如 WB、IHC 等，都是通過二抗類的試劑標記達到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實驗，可能就會使用到直接標記的一抗，比如流式實驗。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍，針對不通的參數(shù)要求選擇對應(yīng)的標記物。在免疫熒光雙標實驗中，需要選配不同的熒光標記物。