細(xì)胞長期保存方法解說

      細(xì)胞是生命的基本單位。（除了病毒特殊一點(diǎn)。）細(xì)胞由細(xì)胞核組成和細(xì)胞膜還有線粒體等組成。常見的保存還是細(xì)胞屬于活躍狀態(tài)的常溫保存或者根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行培養(yǎng)箱的溫度調(diào)整保存, 如下是做為長期保存的方法：

1、冰凍保存：冰凍保存是最常見和簡便的細(xì)胞保存方法之一。使用液氮或低溫冰箱將細(xì)胞培養(yǎng)物冷凍保存在-80°C或更低的溫度下。常用的冷凍液包括含有10%-20% DMSO（二甲基亞砜）的細(xì)胞保存液。

2、液氮保存：將細(xì)胞冷凍保存在液氮中，通常使用特殊的液氮保存管。液氮保存溫度為-196°C，對于長期保存非常理想。在液氮保存時(shí)，細(xì)胞最好被冰凍在含有保護(hù)劑的凍存液中。

3、高溫滅活保存：將細(xì)胞通過加熱處理使其失去生物活性，常見的方法包括烘干、滅菌和石蠟包埋。這些方法適用于某些特定類型的細(xì)胞，如細(xì)菌和酵母菌。

4、凍干保存：將細(xì)胞冷凍干燥，以保存更長的時(shí)間。將細(xì)胞培養(yǎng)物先冷凍至低溫，然后在真空條件下將凍結(jié)的水分直接轉(zhuǎn)化為氣體，最后封閉在密封的容器中。

一、冷凍保存方法：
1）、傳統(tǒng)方法:
冷存管置于4 ℃10分鐘--->-20 ℃30分鐘--->-80 ℃ 16～18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。-20 ℃不可超過1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
2）、程序降溫：
利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3 ℃/分鐘之速度由室溫降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。

二、 操作步驟：
1）、冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。
2）、配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
3）、離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0. 1 ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
4）、取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO后濃度為5～10%)，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1～2 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。

三、 注意事項(xiàng)：
1）、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80～90%致密度。冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
2）、細(xì)胞在液氮中可長期凍存無限時(shí)間，而不會影響細(xì)胞活力;在-70度可保存數(shù)月。
3）、注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0. 22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小體積分裝，4 ℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲，可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化，可換用10%甘油凍存。