已應(yīng)用于基因組編輯的基因修飾

基因修飾已被應(yīng)用于多種生物，包括人、小鼠、大鼠、斑馬魚、秀麗隱桿線蟲、植物及細(xì)菌。其技術(shù)也不斷被拓展，如利用多個(gè)引導(dǎo)RNA序列可同時(shí)進(jìn)行基因組上多個(gè)不同位點(diǎn)的編輯；將其DNA結(jié)合域與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白相融合，可實(shí)現(xiàn)對特定基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制；將對特定序列的調(diào)控蛋白模塊與基因組或表觀基因組的修飾酶相融合，則可實(shí)現(xiàn)對基因組的動(dòng)態(tài)控制。慢病毒是目前轉(zhuǎn)染領(lǐng)域運(yùn)用最多的一種技術(shù)，通過構(gòu)建慢病毒包裝質(zhì)?？梢愿咝У膶⒛康幕蛘系郊?xì)胞的染色體上，實(shí)現(xiàn)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染和達(dá)到降低昂貴轉(zhuǎn)染試劑的效果。 基因修飾主要有4種不同的人工核酸內(nèi)切酶已應(yīng)用于基因組編輯：巨核酶技術(shù)、鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)。與RNA靶向DNA內(nèi)切酶Cas9、ZFN與TALEN均可通過蛋白一DNA相互作用識(shí)別基因組上的特定DNA序列。巨核酶技術(shù)具有核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合域，而ZFN與TALEN分別具有可識(shí)別3個(gè)與1個(gè)核苷酸的DNA結(jié)合域，需與核酸內(nèi)切酶FokI的內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白后，完成基因組特定位點(diǎn)的切割。 但這些技術(shù)各有不足，如巨核酶技術(shù)的氨基酸殘基與DNA靶序列之間無明確特異性；ZFN的DNA結(jié)合域則會(huì)受DNA靶序列上下游的影響，需通過構(gòu)建不同的融合蛋白來定位到不同的DNA序列，構(gòu)建操作較為繁瑣，成本較高，脫靶風(fēng)險(xiǎn)較高。RNA靶向內(nèi)切酶CRISPR—Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)則通過一段短的引導(dǎo)RNA(guideRNA)來識(shí)別特定的DNA序列，只需通過改變這段引導(dǎo)RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列。