流式細(xì)胞儀(Flow cytometer )是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來。多數(shù)流式細(xì)胞計(jì)是一種零分辨率的儀器，它只能測(cè)量一個(gè)細(xì)胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測(cè)出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細(xì)節(jié)分辨率為零。

      

工作原理:

下面分別簡(jiǎn)要介紹流式細(xì)胞儀有關(guān)的參數(shù)測(cè)量、樣品分選原理。

參數(shù)測(cè)量原理

流式細(xì)胞儀可同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，信息主要來自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。測(cè)量是在測(cè)量區(qū)進(jìn)行的，所謂測(cè)量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流中央的單個(gè)細(xì)胞通過測(cè)量區(qū)時(shí)，受到激光照射會(huì)向立體角為2π的整個(gè)空間散射光線，散射光的波長(zhǎng)和入射光的波長(zhǎng)相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物學(xué)參數(shù)又和細(xì)胞對(duì)光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細(xì)胞對(duì)光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號(hào)對(duì)不經(jīng)染色活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過固定的和染色處理的細(xì)胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號(hào)當(dāng)然不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。

在流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量中，常用的是兩種散射方向的散射光測(cè)量:①前向角(即0角)散射(FSC);②側(cè)向散射(SSC)，又稱90角散射。這時(shí)所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對(duì)同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大;對(duì)球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系;對(duì)于形狀復(fù)雜具有取向性的細(xì)胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測(cè)量主要用來獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。

在實(shí)際使用中，儀器首先要對(duì)光散射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時(shí)，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細(xì)胞。光散射測(cè)量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

熒光信號(hào)主要包括兩部分:①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色，細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光;②特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)，在多數(shù)情況下會(huì)干擾對(duì)特異熒光信號(hào)的分辨和測(cè)量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測(cè)量中，對(duì)于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個(gè)關(guān)鍵。一般說來，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子(例核黃素、細(xì)胞色素等)的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng);培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng);細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。

減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是:①盡量選用較亮的熒光染料;②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng);③采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。