在定量PCR（也稱rt-PCR或qPCR）中，熒光信號(hào)是由熒光探針或熒光DNA結(jié)合染料（如SYBR Green）產(chǎn)生，其強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物分子（擴(kuò)增子）的數(shù)量成正比。每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，收集熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過將熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)作圖，qPCR儀生成擴(kuò)增曲線，其表示在整個(gè)PCR過程中產(chǎn)物的累積，通過這個(gè)過程，即可實(shí)現(xiàn)量化。熒光定量PCR試劑操作流程：RNA 提取 → 反轉(zhuǎn)錄 → 設(shè)計(jì)引物 → Q-PCR，下面來介紹總RNA提取操作過程：

A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。

B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。

C細(xì)胞樣品：懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞后，每1×105?106細(xì)胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲(chǔ)存一個(gè)月。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，有兩種處理方法。一種是移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞?；蚴窍扔靡鹊鞍酌笇①N壁細(xì)胞消化下來并收集后，再加入1mL Trizol進(jìn)行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細(xì)胞去除殘余培養(yǎng)基。）

1. 直接法

1）加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。

2）4℃，12000rpm離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中。

3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。

4）4℃，12000rpm離心15min。混合液分三層，包括最下面的苯酚 - 氯仿有機(jī)相，中間相和上層水相。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。∟ote：質(zhì)量比數(shù)量更重要！）

5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。

6）4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。

7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風(fēng)干5-10min（不要太干，過度干燥會(huì)導(dǎo)致RNA難溶解?。NA溶于15μl-50μlDEPC水中。

8）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長(zhǎng)期保存。

2 、離心柱法(依據(jù)RNA提取試劑盒說明書)

1）1、中步驟1）—4）。

2）加入1/2體積的無水乙醇，輕柔顛倒混勻。如有透明的纖維狀物體，不影響下游步驟。

3）將所有裂解物/乙醇混合物轉(zhuǎn)移至離心柱，置于2mL，靜置2min。4℃，12000rpm離心3min，棄廢液。

4）加入500uL洗滌液，靜置2min。4℃，12000rpm離心30秒，棄廢液。重復(fù)一次。

5）4℃，10,000rpm離心2min以除去殘留的乙醇。

6）將離心柱置于新的RNase-free EP管中，加入30ul-50ulDEPC水，靜置5min， 12000rpm離心2min收集。

7）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長(zhǎng)期保存。