實時熒光PCR技術(shù)進行核酸檢測過程

 
核酸檢測是查找患者的呼吸道標本、血液或糞便中是否存在外來入侵的病毒的核酸，來確定是否被新冠病毒感染。因此一旦檢測為核酸“陽性”，即可證明患者體內(nèi)有病毒存在。核酸檢測，從基因水平檢測病毒，具有高度的敏感度和特異度，且克服了病毒分離鑒定耗時長。核酸檢測的物質(zhì)是病毒的核酸?？乖瓩z測窗口期的缺點，2019-nCoV屬RNA病毒，需要先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行擴增檢測，通過熒光定量PCR所得到的樣本Ct值得大小，可以判斷患者樣本中是否含有SARS-CoV-2。

RT-PCR技術(shù)原理：

Real-time quantitative PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產(chǎn)生，通過熒光信號不斷累積而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR全程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達預(yù)先設(shè)定的閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高，Ct值越小。

熒光閾值：PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是3~15個循環(huán)的熒光信號標準偏差的10倍；

Ct值：C代表Cycle，t為threshold，Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

檢測流程：

檢測主要經(jīng)過取樣、留樣、保存、核酸提取、上機檢測等五個步驟：

① 取樣：用咽拭子擦拭咽后壁及雙側(cè)咽扁桃體處各5~10次，且不斷旋轉(zhuǎn)拭子；

② 留樣：將拭子頭浸入細胞保存液中，折斷尾部后立即旋緊管蓋子，進行留樣；

③ 保存：將樣品2~8℃保存，并及時送檢；

④ 核酸提?。簩缁畈《竞蟮臉颖具M行核酸提??；用于后續(xù)檢測；

⑤ RT-PCR核酸檢測：將提取物進行RT­-PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)時間約為70~80min。

優(yōu)勢：

① 縮短了檢測時間，提高了檢測效率，降低檢測過程中可能出現(xiàn)的污染和假陽性；

② 可通過繪制融解曲線、使用特異性探針等方式降低非特異性擴增，所以相比于常規(guī) RT-PCR，其具有操作簡便快捷，特異度強，靈敏度高等優(yōu)點。