蛋白試劑盒使用方法步驟

BCA蛋白試劑盒是進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定的最常見的方法之一。BCA蛋白定量的主要原理是：蛋白質(zhì)在堿性條件下，可以將二價Cu2+離子還原成一價Cu+離子。產(chǎn)生的一價Cu+離子可以與BCA（Bicinchoninicacid）試劑結(jié)合，最終生成紫色的復(fù)合物。該復(fù)合物在562nm處有很強的吸收峰。復(fù)合物的多少與蛋白質(zhì)的濃度呈接近的線性關(guān)系。
　使用方法步驟：
1、BCA工作液的配制
（1）BCA工作液總體積的計算：
BCA工作液總體積=（標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量+待測樣品數(shù)量+1）×重復(fù)數(shù)×200μL。
舉例：如果標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量為8，待測樣品數(shù)量1，重復(fù)數(shù)為3，則BCA工作液總體積=（8+1+1）×3×200μL=6000μL
（2）BCA工作液的配制：按50體積的BCA試劑A中加入1體積的BCA試劑B（A:B=50:1），充分混勻。
舉例：將5000μL的BCA試劑A與100μL的BCA試劑B混合，得到5100μL的BCA工作液。

　2、BSA標(biāo)準(zhǔn)品的配制
將BSA標(biāo)準(zhǔn)品做系列稀釋，分別得到如下9個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。
注：嚴(yán)格的蛋白定量，BSA標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶液應(yīng)該與待測蛋白樣品的溶液相同。但是一般情況下，BSA標(biāo)準(zhǔn)品可以直接用0.9%的NaCl、PBS或者去離子水進(jìn)行稀釋。
　
3、取BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品各25μL到96孔板孔內(nèi)，
注：正常情況下，樣品與BCA工作液的體積之比應(yīng)為1:8。如果樣品體積有限，也可使用10μLBSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品進(jìn)行檢測（即樣品與BCA工作液的體積之比為1:20），這時BCA定量試劑盒的檢測范圍較小為125-2000μg/mL。

　4、往每孔中加入200μL的BCA工作液，蓋上96孔板蓋子。

5、將96孔板放37℃，30分鐘。

6、用酶標(biāo)儀測562nm處的光吸收值。
注：562nm為最強的光吸收波長。如果無法檢測562nm處的光吸收值，也可以在540～595nm波長范圍內(nèi)檢測光吸收值。

7、根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收值（扣除空白孔的光吸收值即為最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的蛋白濃度。