了解選擇適合實驗二抗需考慮方面

 二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標簽。由于二抗所具備的優(yōu)點使得其在免疫學實驗中得以應用廣泛，如ELISA（以偶聯(lián)有酶的抗體或抗原為標記來檢測特異性的蛋白質(zhì)，尤其是相應的抗原或抗體），免疫組織化學（檢測組織中的特異性抗原），western blot（通過與特異性抗體結合來鑒定蛋白質(zhì)），免疫沉淀（通過抗原與抗體的特異性結合作用來分離相應抗原）,免疫細胞化學（通過免疫學方法檢測細胞的抗原組成），流式細胞術（通過檢測激光所激發(fā)熒光來鑒定分離不同類型的細胞）等。
二抗針對某一特定物種（如小鼠）的抗體均具有特異性，因而使用標記的二抗可以免去對每一個一抗進行標記，節(jié)省了時間和費用；此外，一個一抗分子可以同時結合幾個二抗分子，從而使信號增強，提高了實驗靈敏度。二抗可以偶聯(lián)有幾種不同的標記，可以是酶，熒光素，或生物素。如何選擇二抗？通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到適合該實驗的二抗，需要綜合以下幾個方面進行考慮：
1、一抗的種屬來源
根據(jù)一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。如果一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。
2、一抗是屬于哪個類或亞類
除了要與一抗的種屬來源相一致，二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配，這通常是針對單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對復雜些，由于單克隆抗體有不同的類別和亞型，因此相應的二抗也需要根據(jù)這些亞型進行選擇。
3、二抗的種屬來源
一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，此時二抗就不能選山羊或者小鼠來源的。選擇相應的驢來源的二抗，就非常適合做類似雙標的免疫實驗。雙標得2個都抗才行，故選擇第3個種源的抗體。
4、選擇哪種形式的二抗，是整個IgG分子，F(xiàn)ab片段，還是F(ab')2片段？
整個IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。
Fab片段：它們只有一個結合位點，一般用來封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。
F(ab')2片段：該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用于結合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況。
5、二抗的偶聯(lián)標記
一般來講，偶聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA，常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗（組織免疫化學，細胞免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。
6、抗體的純度
親和層析純化的抗體一般更受歡迎，因為這些產(chǎn)品的純度更高，產(chǎn)生的非特異性背景也少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分，因為其中含有親和力高的抗體，尤其是當目的抗原存在的量較小的時候。