qPCR引物設(shè)計(jì)原則：

1. 引物應(yīng)在核酸保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性；

2. 引物長(zhǎng)度一般在17-25個(gè)堿基之間，上下游引物長(zhǎng)度不宜相差太大；

3. 引物G+C含量應(yīng)在40%-60%之間，最好在45%-55%之間，引物中堿基要隨機(jī)分布；

4. 引物Tm值在58-62°C之間，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超過5°C；

5. 引物3’端要避開密碼子的第3位；

6. 引物的5’端可以修飾，而3’端不可以修飾；

7. 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-200 bp，最長(zhǎng)不要超過300 bp；

8. 擴(kuò)增產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

探針設(shè)計(jì)原則：

1. 探針位置應(yīng)盡可能接近正向或者反向引物，但是不能與之有重合區(qū)域；

2. 探針長(zhǎng)度通常在25-35 bp之間，保證結(jié)合的特異性；

3. 探針的Tm值通常在65-70℃之間，比引物的Tm值高5–10℃，確保探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定性大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性，GC含量在40-60%；

4. 探針5'端不應(yīng)含G，因?yàn)?’端G能夠淬滅熒光信號(hào)，避免報(bào)告基團(tuán)的熒光在探針切割后發(fā)生淬滅。

5. 應(yīng)避免連續(xù)相同的堿基出現(xiàn)，特別是連續(xù)GGGG；

6. 如果序列中包含多態(tài)性位點(diǎn)，應(yīng)使其位于探針序列中間；

7. 5’端熒光報(bào)告基團(tuán)與3’端淬滅基團(tuán)選擇：

1）、選擇報(bào)告基團(tuán)時(shí)確認(rèn)最大激發(fā)波長(zhǎng)（Excitation wavelength，Ex）和最大發(fā)射波長(zhǎng)（Emission wavelength，Em）與儀器是匹配的。對(duì)于多重反應(yīng)，標(biāo)記不同探針的報(bào)告基團(tuán)的最大發(fā)射波長(zhǎng)（Em）應(yīng)該至少有15 nm的差異。

2）、對(duì)于淬滅熒光基團(tuán)，必須要保證其吸收光譜與報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射光譜有重合。