ELISA檢測(cè)考慮的共同階段小結(jié)

    通用有四種主要的ELISA類型，直接法、間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。抗原的測(cè)定和抗體的測(cè)定有同樣的原理，只是抗原和一級(jí)抗體的作用相反。雖然不同類型的ELISA方案有差異，但大多數(shù)檢測(cè)都有一些應(yīng)該考慮的以下共同的階段。

1、板包被
大多數(shù)ELISA檢測(cè)第一步是將檢測(cè)的第一個(gè)成分與包被板結(jié)合。這通常是通過被動(dòng)吸附完成的，一個(gè)非特異性的過程，所以結(jié)果將取決于涂在包被板上的東西。

如果使用了含有抗原的樣品，那就需要一個(gè)具有選擇性的包被板，因?yàn)楦鞣N抗原都會(huì)結(jié)合，而不僅僅是那些感興趣的。然而，如果像用于抗體檢測(cè)的ELISA間接法那樣使用純化抗原，或像ELISA夾心法那樣使用捕獲抗體，那么我們已經(jīng)準(zhǔn)備了一個(gè)具有選擇性的包被板。

包被板的類型大多數(shù)是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，其具有不同的結(jié)合特性，這取決于目標(biāo)物質(zhì)和檢測(cè)的性質(zhì)。一些目標(biāo)物質(zhì)，包括重度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂類、短肽和有洗滌劑的蛋白質(zhì)，是不能很好吸附的。在這些情況下，建議使用經(jīng)過處理允許共價(jià)連接到表面的包被板。

2、孵育
將試劑加入ELISA板后，必須進(jìn)行孵育，以便有時(shí)間進(jìn)行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和時(shí)間將取決于檢測(cè)步驟和正在進(jìn)行的操作。通常在樣品應(yīng)用之后，與37℃下孵育1小時(shí)。

然而，像阻斷這樣的步驟可以在冰箱中過夜，測(cè)定過程中的孵育通常在室溫下進(jìn)行，時(shí)間短得多。

3、洗滌
洗板是在應(yīng)用在檢測(cè)每個(gè)組成部分之間，直到結(jié)果測(cè)定的一個(gè)重要步驟。溶液從孔中排空后，通常使用磷酸鹽緩沖鹽水-20（PBST）做為緩沖液清洗孔，以去除任何殘留的未結(jié)合抗原、抗體或試劑。

這可以用多通道移液器手工完成，或使用自動(dòng)洗板機(jī)。

不充分的清洗可能會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào)，而過多的清洗會(huì)導(dǎo)致樣品信號(hào)低。不一致的清洗可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)板塊的不一致，從而導(dǎo)致不可靠的結(jié)果。

4、阻斷
在用蛋白質(zhì)包被ELISA板后，阻斷通常是必要的，以防止在接下來方案步驟中測(cè)定抗體的任何非特異性結(jié)合。

              阻斷過程如何防止非特異性結(jié)合

與檢測(cè)無(wú)關(guān)的混合蛋白被添加到板中并進(jìn)行孵育，占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。常見的蛋白質(zhì)阻斷緩沖液選擇包括脫脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。

另外，非離子洗滌劑，如Tween 20或Triton X-100，可作為阻斷劑使用，但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永久性阻斷。無(wú)效的板塊阻斷會(huì)導(dǎo)致背景噪音增加，降低檢測(cè)的靈敏度和特異性。

5、抗體
實(shí)驗(yàn)性抗體是大多數(shù)ELISAs的基石，選擇正確的抗體至關(guān)重要，特別是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，它們都有各自的有點(diǎn)和缺點(diǎn)。單克隆抗體提供高特異性，但成本較高。另一方面，多克隆抗體可以在多個(gè)結(jié)合點(diǎn)與目標(biāo)結(jié)合，放大信號(hào)并提高靈敏度。

使用采用二級(jí)抗體的方法增加了額外的步驟，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，增加了出錯(cuò)機(jī)會(huì)，需要更多優(yōu)化來找到合適的兼容抗體對(duì)。然而，使用多克隆二級(jí)抗體所帶來的靈敏度提高可能使其成為一種值得或必須的有效檢測(cè)方法發(fā)展方向。

6、測(cè)定
無(wú)論使用哪種ELISA類型，最后一步都是測(cè)定步驟，最常見的是利用酶介導(dǎo)的可見顏色變化化學(xué)反應(yīng)，然后可以用紫外-可見分光光度法測(cè)量。

酶結(jié)合抗原或抗體被應(yīng)用到測(cè)試孔中，如果目標(biāo)存在，它就會(huì)與之結(jié)合。當(dāng)酶的適當(dāng)?shù)孜锉惶砑拥桨话迳蠒r(shí)，它會(huì)引起顏色變化，與孔內(nèi)結(jié)合的目標(biāo)物的數(shù)量成正比。辣根過氧化物酶（HRP）是一種常用共軛物，一般與底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）合作使用。底物在HRP的作用下變成藍(lán)色，然后在加入硫酸溶液后變成黃色，停止反應(yīng)。

然后可以用酶標(biāo)儀（在TMB加入終止液后，在450nm波段測(cè)定），這是一種紫外可見分光光度計(jì)，來確定每個(gè)孔的吸光度值，并根據(jù)檢測(cè)設(shè)計(jì)進(jìn)行校正和計(jì)算，如減去空白孔平均值、技術(shù)重復(fù)平均值或與標(biāo)準(zhǔn)比率計(jì)算。