PCR引物合成具體操作步驟

PCR中引物的作用：找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。

PCR引物合成是指通過(guò)測(cè)定引物的OD值，溶解引物，最終合成引物的一個(gè)完善的過(guò)程。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過(guò)3′→5′磷酸二酯鍵連接。

       引物合成圖

PCR引物合成具體操作步驟：

1、是將預(yù)先連接在固相載體上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯yi酸反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5′-羥基。

2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷ya 磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。

3、帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2%)，用yi酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在后續(xù)環(huán)節(jié)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來(lái)選擇純化方式分離掉。引物合成圖

4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

   　經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯yi酸脫去它的5′-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過(guò)程中可以觀(guān)察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過(guò)an水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來(lái)，通過(guò)OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測(cè)定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。