ELISA間接法操作步驟

 ELISA間接法實(shí)驗(yàn)原理是將抗原直接固定在固相載體上，用酶標(biāo)記的二級(jí)抗體去辨識(shí)一級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原量，此一級(jí)抗體的特異性非常重要。間接法操作步驟具體如下：

操作步驟：
1、抗原包被過(guò)夜（12h以上）： IgG抗原，用包被液（CBS）稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中。4℃放置過(guò)夜。

抗原用量：0.1μg*100N/抗原濃度 （N為板數(shù)）
2、封閉：棄上清 加300μL/孔封閉液，37℃放置2h。
3、洗滌：用洗滌液洗3次
4、加一抗(待測(cè)樣品為細(xì)胞培養(yǎng)上清)：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清100μL /孔加到已包被的板上，空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品血清（1：200稀釋于1%BSA+PBST中）作為陽(yáng)性對(duì)照。37℃恒溫箱溫育2h。
測(cè)免疫效價(jià)待測(cè)樣品為小鼠血清時(shí)：采小鼠血液于常溫20min左右后放4℃至析出血清，3000r 10min離心。將含抗體的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST連續(xù)倍比稀釋(按照1：200開(kāi)始)，100μL /孔。每個(gè)樣品平行做兩份，小鼠陰性血清或空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。37℃恒溫箱溫育2h。
5、洗滌：用洗滌液洗5次。
6、加二抗（酶標(biāo)抗抗體）：羊抗鼠IgG-HRP，用1%BSA+PBST l ：10000稀釋，100μL／孔， 37℃恒溫箱溫育1h。
7、洗滌：用洗滌液洗5次，
8、顯色：加新鮮配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔，37℃恒溫箱放置10min，顯示藍(lán)色。
9、終止反應(yīng)、比色：加30μL/孔H2SO4終止液．顏色變黃；用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm 630nm處各孔的吸光值，陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。