支原體(Mycoplasma)是最小、zui簡單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，所以針對(duì)細(xì)胞壁的許多常見的抗生素，如青霉su 或β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)支原體無效；支原體大小介于細(xì)菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過0.22μm濾器，常規(guī)的過濾對(duì)支原體無效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營養(yǎng)，所以通常吸附或散落在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。支原體的這些特征使細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)，細(xì)胞的支原體污染已經(jīng)成為一個(gè)世界性的普遍問題。
   支原體污染可能會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的狀態(tài)，使細(xì)胞的基因表達(dá)、代謝特征發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞生長減緩、分化和死亡異常，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。這些影響因素會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性和一致性，因此支原體污染的檢測非常重要。細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌、酵母或霉菌污染在光學(xué)顯微鏡下可見，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下通常不可見，必須通過特定的檢測方法進(jìn)行檢測。檢測支原體污染的常用方法有支原體分離培養(yǎng)、ELISA、發(fā)光法等特殊的生化檢測以及DNA熒光染色檢測等。上述檢測方法中，大多操作步驟相對(duì)比較煩瑣、靈敏性不高、不能區(qū)分支原體種類、需要特殊儀器或所需時(shí)間較長。而PCR法操作相對(duì)比較簡單便捷，PCR擴(kuò)增后通過電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據(jù)擴(kuò)增片段的大小大致預(yù)測至少11種所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測序以確定具體的支原體種屬。
   支原體PCR檢測試劑盒是利用兩對(duì)引物通過巢式PCR法特異性擴(kuò)增支原體基因組DNA段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的高靈敏度特異性檢測的。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)(space region)在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區(qū)。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長度在支原體各個(gè)種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區(qū)DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)F1/R1引物，用于擴(kuò)增16S和23S之間的間隔區(qū)，這就是巢式PCR的第一輪PCR (1st PCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條R2引物進(jìn)行巢式PCR的第二輪PCR (2nd PCR)。通過巢式PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度。