EASYspin 全血 RNA 快速提取試劑盒 (DNase I )

商品屬性：

產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號(hào)
EASYspin 全血 RNA 快速提取試劑盒 (DNase I )	50 次	BJ-PJ6325

商品介紹：
保存條件：本試劑盒在規(guī)定保存溫度儲(chǔ)存 12 個(gè)月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹：
紅細(xì)胞裂解液選擇性裂解紅細(xì)胞,然后獨(dú)特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解白細(xì)胞 和滅活細(xì)胞 RNA 酶，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸 附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液 將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的 RNase free H2O 將 RNA 從硅基質(zhì)膜上洗 脫。
自備試劑：乙醇，β-巰基乙醇
注意事項(xiàng)：
1.第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
2.需要自備一次性注射器。
3.裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4.關(guān)于DNA的微量殘留：
由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和選擇了特殊吸附能力的吸附膜，在大多數(shù)RT-PCR 擴(kuò)增過程中極其微量的 DNA 殘留（一般電泳 EB 染色紫外燈下觀察不可見）影響不是很大，如果要進(jìn)行嚴(yán)格的 mRNA 表達(dá)量分析如熒光定量 PCR，我們建議在進(jìn)
行模板和引物的選擇時(shí)：
⑴選用跨內(nèi)含子的引物，這樣 DNA 就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。
⑵選擇基因組 DNA 和 cDNA 上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。
5.RNA 純度及濃度檢測(cè)：
完整性：RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度 1.2%；0.5×TBE 電泳緩沖液；150V，15 min)檢測(cè)完整性。由于細(xì)胞中 70%-80%的 RNA 為 rRNA，電泳后 UV下應(yīng)能看到非常明顯的 rRNA 條帶。動(dòng)物 rRNA 大小分別約為 5 kb 和 2 kb，分別相當(dāng)于 28S 和 18S rRNA。動(dòng)物 RNA 樣品中最大 rRNA 亮度應(yīng)為次大 rRNA 亮度的 1.5-2.0倍，否則表示 RNA 樣品的降解。出現(xiàn)彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴(yán)重降解。
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的 RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10 mMTris, pH7.5）在 1.8-2.1 之間。OD260/OD280 讀數(shù)受測(cè)定所用溶液的 pH 值影響。同一個(gè) RNA 樣品，假定在 10 mM Tris，pH7.5 溶液中測(cè)出的 OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測(cè)讀數(shù)則可能在 1.5-1.9 之間，但這并不表示 RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free 水稀釋 n 倍，用 RNase-free 水將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行 OD260，OD280測(cè)定，按照以下公式進(jìn)行 RNA 濃度的計(jì)算：
終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù) n)×40
操作步驟：
? 使用前將 10×RLB（RNase-free）用 DEPC 處理水稀釋到 1×。
? 操作前在裂解液 RLT 中加入β-巰基乙醇至終濃度 1%，如 1 ml RLT 中加入 10 μl β- 巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RLT 4℃可放置一個(gè)月。
1.在適合大小的RNase free離心管中加入1體積（<1.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液 (顛倒混勻后)和 3 體積的 1×RLB（RNase free），顛倒混勻，可輕彈管壁,確保混勻。
2.室溫放置 10 min（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細(xì)胞）。如果 RNA 降解嚴(yán)重,可在冰上裂解,但是時(shí)間可長一些以充分裂解。
3.12,000 rpm 離心 20 sec，倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)。如發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞大量殘留可重復(fù) 2，3 步驟。
4.渦旋或者輕彈管壁將白細(xì)胞沉淀完全松散重懸，加 350 μl（<0.5 ml 全血或<2×10 6白 細(xì)胞）或者 600 μl（0.5-1.5 ml 全血或 2×10 6-1×10 7 白細(xì)胞）裂解液 RLT，吹打混勻 后用手劇烈振蕩 20 sec，充分裂解。
5.用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配 0.9 mm 針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿 意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿 30 sec)，可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
6.較精確估計(jì)裂解物體積，加入等體積的 70%乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!）， 此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
7.將混合物(每次小于 700 μl，多可以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱 RA 中（吸附柱放入 收集管中），12,000 rpm 離心 30-60 sec，棄掉廢液。
8.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室溫放置 30 sec，12,000 rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。將吸 附柱 RA 放回收集管中。
9.DNase I 工作液的配制：取 10 μl DNase I 儲(chǔ)存液放入新的 RNase-free 離心管中，加入 70 μl RDD 溶液，輕柔混勻。
10.向吸附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液，室溫放置 15 min（一般情況下室溫放 置可得到較好的消化效果，如果室溫效果不佳可選擇在 37℃放置 15 min）。
11.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室溫放置 30 sec，12,000 rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。將 吸附柱 RA 放回收集管中。
12.加入 500 μl 漂洗液 RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心 30 sec， 棄掉廢液。加入 500 μl 漂洗液 RW，重復(fù)一遍。
13.將吸附柱 RA 放回空收集管中，12,000 rpm 離心 2 min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分 鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。