EASYspin 組織 / 細(xì)胞 RNA 快速提取試劑盒 (DNase I)

商品屬性：

產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號(hào)
EASYspin 組織 / 細(xì)胞 RNA 快速提取試劑盒 (DNase I)	50 次	BJ-PJ6326

商品介紹：

保存條件：本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 12 個(gè)月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹：
獨(dú)特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞 RNA 酶，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié) 合條件后,RNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速 的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽 的 RNase free H2O 將純凈 RNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
自備試劑：乙醇, β-巰基乙醇
注意事項(xiàng)：
1.需要自備一次性注射器，研缽。裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操 作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清 水或者生理鹽水沖洗。
2.關(guān)于DNA 的微量殘留：
一般說來任何總 RNA 提取試劑在提取過程中無法完全避免 DNA 的微量殘留， 本公司的 EASYspin 系列 RNA 提取產(chǎn)品，在大多數(shù) RT-PCR 擴(kuò)增過程中極其微量的 DNA 殘留（一般電泳 EB 染色紫外燈下觀察不可見）影響不是很大，如果要進(jìn)行嚴(yán) 格的 mRNA 表達(dá)量分析如熒光定量 PCR，我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)： 1）選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過 mRNA 中的連接區(qū)，這樣 DNA 就不能作為模板參與 擴(kuò)增反應(yīng)。 2）選擇基因組 DNA 和 cDNA 上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。

 操作步驟：
提示：
? 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入指定量無水乙醇!
? 操作前在裂解液 RLT 中加入β-巰基乙醇至終濃度 1%，如 1 ml RLT 中加入 10 μl β- 巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RLT 4℃可放置一個(gè)月。
1.組織培養(yǎng)細(xì)胞
a.收集<107懸浮細(xì)胞到一個(gè) 1.5 ml 離心管，對(duì)于貼壁細(xì)胞，孔板培養(yǎng)可以直接裂解，細(xì)胞瓶培養(yǎng)應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來收集。
b.12,000 rpm 離心 10 sec（或者 300×g 離心 5 min），使細(xì)胞沉淀下來。完全吸棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)，注意不完全棄上清會(huì)稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。
c.輕彈管壁將細(xì)胞沉淀完全松散重懸，加入 350 μl（<5×106 細(xì)胞）或者 600 μl（5×106-1×107細(xì)胞）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩 20 sec，充分裂解。
d.用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配 0.9 mm 針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果（或者電動(dòng)勻漿 30 sec），可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
e.接操作步驟項(xiàng)下 3。
2.動(dòng)物組織（例如鼠肝腦）
a.電動(dòng)勻漿：新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊，加入 350 μl(<20 mg 組織)或者600 μl(20-30 mg 組織)的裂解液 RLT 后電動(dòng)徹底勻漿 20-40 sec。
b.液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，取適量組織細(xì)粉(20 mg/30 mg)轉(zhuǎn)入裝有 350 μl/600 μl 組織裂解液 RLT 的 1.5 ml 離心管中，用手劇烈振蕩 20 sec，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配 0.9 mm 針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果（或者電動(dòng)勻漿 30 sec），可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
c.將勻漿后裂解物 12,000 rpm 離心 3 min，沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物，將裂解物上清小心轉(zhuǎn)到一個(gè)新離心管。
d.接操作步驟項(xiàng)下 3。
3.較精確估計(jì)裂解物（上清）體積，加入等體積的 70%乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
4.立刻將混合物（每次小于 700 μl，多可以分兩次加入）加入一個(gè)吸附柱 RA 中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm 離心 60 sec，棄掉廢液。
5.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室溫放置 30 sec，12,000 rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。
6.DNase I 工作液的配制：取 10 μl DNase I 儲(chǔ)存液放入新的 RNase-free 離心管中，加入70 μl RDD 溶液，輕柔混勻。
7.向吸附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液，室溫放置 15 min（一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果，如果室溫效果不佳可選擇在 37℃放置 15 min）。
8.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室溫放置 30 sec，12,000 rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。
9.加入 500 μl 漂洗液 RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。加入 500 μl 漂洗液 RW，重復(fù)一遍。
10.將吸附柱 RA 放回空收集管中，12,000 rpm 離心 2 min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11.取出吸附柱 RA，放入一個(gè) RNase free 離心管中，根據(jù)預(yù)期 RNA 產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加 30-50 μl RNase free H2O（事先在 65℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置 1 min，12,000 rpm 離心 1 min。