Carboxyl-Terminated Magnetic Beads 羧基磁珠

商品屬性：

產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號(hào)
Carboxyl-Terminated Magnetic Beads 羧基磁珠	20mg	BJ-PJ6382

商品介紹：

產(chǎn)品介紹： Carboxyl-Terminated Magnetic Beads 是均勻的，表面覆蓋有高密度羧基官能團(tuán)的 二氧化硅基質(zhì)的磁珠。它的親水性表面基團(tuán)保證了磁珠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，具有極低的非 特異性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各種緩沖液中處理。磁珠表面上高密度 的具有懸垂功能性的羧基基團(tuán)，可以通過(guò)形成穩(wěn)定的酰胺鍵共價(jià)結(jié)合含伯胺的配體。 Carboxyl-Terminated Magnetic Beads 適合結(jié)合大的蛋白質(zhì)。 Long-arm Carboxylterminated Magnetic Beads 建議結(jié)合小分子肽回收， 因?yàn)殚L(zhǎng)臂的親水連接基團(tuán)可以減 少位阻現(xiàn)象。 Carboxyl-Terminated Magnetic Beads 可以完美地作為各種生物分離實(shí)驗(yàn)的親和材 質(zhì)，將分子、細(xì)胞和部分細(xì)胞提取物進(jìn)行提煉純化。在與配體結(jié)合后，將磁珠添加到 含有目標(biāo)分子的樣品中，然后混合、孵育、洗滌和洗脫目標(biāo)分子。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
· 便于使用
· 穩(wěn)定的共價(jià)鍵，低水平的配體泄漏
· 可重復(fù)使用的免疫親和基質(zhì)
· 極低的非特異性結(jié)合率
· 可固定 1-10mg 蛋白或 0.1-1mg 多肽/ml 的磁珠
用途： 用于純化抗體，蛋白質(zhì)/肽，DNA / RNA；細(xì)胞篩選、免疫沉淀

操作步驟：

提示：
1. 強(qiáng)烈建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行滴定優(yōu)化，以確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相 應(yīng)地放大和縮小。
2. Coupling buffers 應(yīng)具有最小的離子強(qiáng)度，且不應(yīng)含有任何具有氨基（如 Tris）或羧基（如 醋酸鹽、檸檬酸鹽）的成分。但 Wash buffers 或者 Storage buffers 可含有氨基或羧基。
所需耗材和試劑：
磁力分離器（適用于手動(dòng)操作）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號(hào)的磁力分離器。
Coupling Buffer: 10 mM K3PO4, 0.15 M NaCl, pH 5.5 或者 0.1 M MES 緩沖液,0.15 M
NaCl, pH 4.5-5.5. EDC [1-ethyl-3 (3-dimethyaminopropyl) carbodiimide], Sigma, Cat# E7750
NHS (N-hydroxysuccinimide), Sigma, Cat#56480
Wash/Storage Buffer: 10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.1% (w/v) BSA, 1mM EDTA, 0.01%疊
氮化鈉, pH 7.5
Blocking buffer: 1 M Glycine, pH 8.0
Ⅰ.一步法偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
提示：一步偶聯(lián)方式適用于不含羧基基團(tuán)的配體，因?yàn)轸然鶊F(tuán)可能與緩沖液中 EDC反應(yīng)并導(dǎo)致配體聚合。但是，由于該方法簡(jiǎn)單且通常具有較高的產(chǎn)率，因此它仍然是首選的耦合方法。為了補(bǔ)償因?yàn)榫酆显斐傻呐潴w損失，可以在偶聯(lián)反應(yīng)中加入較多的配體。
A.磁珠準(zhǔn)備
1. 將 30mg 磁珠與 1ml 的 Coupling buffer 在離心管中混合，并通過(guò)渦旋或移液器吹吸
方式充 分混合。
2. 將試管插入磁力分離器中 1-3 分鐘，直到上清液變的澄清。將試管留在磁力分離器
中的同時(shí)， 用移液器吸出并丟棄上清液。
3. 磁珠準(zhǔn)備用來(lái)偶聯(lián)。
B.蛋白的偶聯(lián)
1. 用 Coupling buffer 制備 1ml 蛋白質(zhì)溶液（0.5-1mg/ml），并與上述所得磁珠混合，
并充分混勻。
2. 制備新鮮的含有 2%的 EDC 溶液的 Coupling buffer。注意：準(zhǔn)備后 15 分鐘內(nèi)使用。
3. 向蛋白質(zhì)溶液中加入 100µl 上述 2% EDC 溶液并充分混合。
4. 室溫條件下，在保持良好混勻情況下過(guò)夜孵育。
C.清除未結(jié)合蛋白
1. 反應(yīng)完成后，將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時(shí)，去除上清液。
2. 清洗磁珠使用 5 ml 的 Wash/storage buffer，重復(fù)三次。
3. 在室溫下用 1ml 的 Blocking buffer，在保持良好混勻情況下將磁珠孵育 1-2 小時(shí)。
4. 使用 5ml 的 Wash/storage buffer 清洗磁珠三次
5. 用所需體積的 Wash/storage buffer 懸浮磁珠，并在 4ºC 下儲(chǔ)存。
II. 兩步偶聯(lián)法實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
提示：兩步方案：該方案適用于含有羧基的配體，或者只有有限數(shù)量的配體可用
A.磁珠準(zhǔn)備
1. 將 30mg 磁珠與 1ml 的 Coupling buffer 在離心管中混合，并通過(guò)渦旋或移液器吹吸方式充分混合。
2. 將試管插入磁力分離器中 1-3 分鐘，直到上清液變的澄清。將試管留在磁力分離器中的同時(shí)， 用移液器吸出并丟棄上清液。
3. 制備新鮮的含有 5% EDC 和 5% NHS 的 Coupling buffer。注意：準(zhǔn)備后 15 分鐘內(nèi)使用。
4. 向含有磁珠的試管中加入 500µl 上述含有 5%EDC 和 5% NHS 的 Coupling buffer 并充分混合。
5. 在室溫下，保持磁珠良好混勻情況下，將磁珠孵育 30 分鐘。
6. 孵育完成后，將試管插入磁力分離器中 1-3 分鐘，直到上清液變的澄清。將試管留在磁力分離器中的同時(shí)，用移液器吸出并丟棄上清液。
7. 清洗磁珠使用 5 ml 冰浴過(guò)的 Coupling buffer，重復(fù)三次。
8. 磁珠準(zhǔn)備用來(lái)偶聯(lián)。
B．結(jié)合蛋白
1. 用 Coupling buffer 制備 1 ml 蛋白質(zhì)溶液（0.5-1mg/ml），并與上述所得已清洗的磁珠混合。
2. 在室溫下孵育過(guò)夜，過(guò)程中確保充分混合。
C.清除未結(jié)合蛋白
1. 反應(yīng)完成后，將試管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當(dāng)磁珠完全吸附到磁力分離器上時(shí)，去除上清液。
2. 使用 5 ml 的 Wash/storage buffer 清洗磁珠，重復(fù)三次。
3. 在室溫下用 1ml 的 Blocking buffer，在保持良好混勻情況下將磁珠孵育 1-2 小時(shí)。
4. 使用 5ml 的 Wash/storage buffer 清洗磁珠三次
5. 用所需體積的 Wash/storage buffer 懸浮磁珠，并在 4ºC 下儲(chǔ)存。
III．通用式親和層析方法
提示：
該方案是一個(gè)通用的親和純化發(fā)法。因?yàn)闆](méi)有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可 能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計(jì)一個(gè)通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個(gè)用戶必須確定純化單個(gè)目標(biāo)蛋白的最佳工作條件。
建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)行滴定，以優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中使用的磁珠數(shù)量。使用過(guò)的磁珠將導(dǎo)致較高的背景，而使用過(guò)少的磁珠將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通常可與 1-20μg 靶蛋白結(jié)合。
1. 將適量的磁珠轉(zhuǎn)移到試管中。將試管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當(dāng)磁珠完全吸附時(shí)， 去除上清液。
2. 取下試管，加 入 5 倍磁珠溶液體積的 PBS 緩沖液，通過(guò)震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30 秒。將試管至于室溫環(huán)境孵育 1-3 分鐘，再將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當(dāng)磁珠完全吸附時(shí)，去除上清液。
3. 重復(fù)步驟 2 兩次。
4. 向含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過(guò)的磁珠，并在室溫或所需溫度下孵育 1-2小 時(shí)（溫度越低，孵育時(shí)間越長(zhǎng)）。
5. 用 5 倍磁珠體積的 PBS 緩沖液或 1M NaCl 徹底清洗磁珠，直到 280nm 處洗滌液的吸光度接近背景水平（OD280<0.05）。
6. 通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ疵撃繕?biāo)蛋白，如低 pH（2-4）、高 pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或 加入 SDS-PAGE 上樣緩沖液煮沸。