反轉(zhuǎn)錄PCR引物的選擇與Real-Time PCR引物設(shè)計的要求

 反轉(zhuǎn)錄PCR引物的選擇與Real-Time PCR引物設(shè)計的要求：

  1、隨機(jī)六聚體引物：

當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2、Oligo(dT)：

是一種僅對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。特別適合檢測多個基因的表達(dá)，這樣可以節(jié)約反轉(zhuǎn)錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達(dá)、從極少量細(xì)胞中定量檢測特定mRNA的表達(dá)水平。

3、特異性引物：

最特異的反轉(zhuǎn)錄方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。

做 Real Time PCR時，用于SYBR Green I/Eva Green 法時的一對引物與一般PCR的引物，在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求： 

① Tm=55-65℃

② GC=30-80% 

③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。 

④引物的退火溫度要高，一般要在 60℃以上。

要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。

至于設(shè)計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不易。