影響PCR反應(yīng)結(jié)果主要成份分析

 PCR反應(yīng)中的主要由引物、 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、Mg ^2+、模板和Taq DNA聚合酶五個成份組成。各個組份都能影響 PCR 結(jié)果的好壞。

1.  引物
PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：
（1） 引物長度約為16-30 bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。
（2）引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
（3）四種堿基應(yīng)隨機分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。
（4）引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。
（5）在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。
（6）兩引物之間尤其在3'端不能互補， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。
（7）引物5'端對擴增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖 體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標(biāo)記生物素、熒光素等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。
（8）引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)， 以免產(chǎn)生非特異性擴增，影響產(chǎn)量。
（9）簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物。
（10）一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體， 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計， 可精確計算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個數(shù)。

2.  4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)
（1）dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計測定其準(zhǔn)確濃度。
（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200 μmol/L。
（3）理論上4 種 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反應(yīng)中合成2.6 μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50 mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。

3.  Mg²⁺
（1）Mg ²⁺濃度對Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度， 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。
（2）通常Mg ²⁺ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg ²⁺ 進行預(yù)備實驗，選出最適的Mg ²⁺濃度。
（3）在PCR反應(yīng)混合物中， 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團， 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg ²⁺ 離子濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg ²⁺ 濃度。

4.  模板
（1）PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進行擴增， 模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好)。
（2）就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個拷貝，對于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時，用量更少。
（3）靈敏的PCR可從一個細(xì)胞，一根頭發(fā)，一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。
（4）模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率。

5.  Taq DNA聚合酶
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。
Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30 min，摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)。
所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。
反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進行下一步實驗，需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR產(chǎn)物經(jīng)酚: 抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg ²⁺ 。
（3） 99-100℃加熱10 min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

6.  反應(yīng)緩沖液
（1）反應(yīng)緩沖液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg _²⁺ 。Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8，但在實際PCR反應(yīng)中，pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
（2）反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利。
（3）各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。