實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)RNA質(zhì)量測(cè)定具體過(guò)程

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。  RNA質(zhì)量測(cè)定：

一.  紫外吸收法測(cè)定

 先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。

 1、濃度測(cè)定 

A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計(jì)算如下：

RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測(cè)得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

取5 ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：

35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

 2、純度檢測(cè) 

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

二.  變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

1、制膠

1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10x MOPS電泳緩沖液

濃度  成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸鈉

0.01 M  EDTA 

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

2、準(zhǔn)備RNA樣品

取3 ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

3、電泳

 上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm。

4、紫外透射光下觀察并拍照 

28S和18S核糖體RNA 的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。