PCR檢測污染問題處理

PCR 檢測微量感染因子時，一定要注意產物殘留污染的問題。
一、環(huán)境污染
1、稀酸處理法：
    對可疑器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA 脫嘌呤；
2、紫外照射（UV）法：
    紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產物污染時，要考慮PCR 產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV 照射僅對500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。UV 照射時，PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 鏈間與鏈內的交聯和DNA 斷裂等）均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。如果這些位點（ 0.13/堿基）在DNA 分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp 的片段，每條鏈上僅有6 處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長度限制的原因。

二、反應液污染
    可采用下列方法之一處理：
1、DNase I 法：
    PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30min 后加熱滅活，然后加入模板和Taq 聚合酶進行正常PCR 擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA 的序列；
2、內切酶法：
    選擇識別4 個堿基的內切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR；
3、紫外照射法：
    未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV 照射法；
4、g 射線輻射法：
    1.5kGy 的輻射可完全破壞0.1ng 基因組DNA，2.0 kGy 可破壞104 拷貝的質粒分子，4.0 kGy 仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR 擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g 射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA 的。

三、尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
    由于UV 照射的去污染作用對500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR 擴增片段通常為300bp 左右，因此UNG 的預防作用日益受到重視和肯定。
1、原理：
    在PCR 產物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產物與UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
2、dUTP 法：
    用dUTP 代替dTTP，使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR 擴增前，用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU 的新的PCR 產物。
3、dU 引物法：
    合成引物時以dU 代dT，這樣PCR 產物中僅5ˊ端帶dU。UNG 處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb 以上）的擴增用dUTP 法效率較用dTTP低，而用dU 法就可克服這一缺點。dU 引物最好將dU 設計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
4、優(yōu)點：
    可以去除任何來源的污染；UNG 處理可以和PCR 擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU 存在，可徹底消除污染源。
5、需注意的是摻入dUT的DNA不應對產物的任何操作有影響，在進行PCR 產物克隆時，應該轉化UNG-（UNG 缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉化產物會被受體菌UNG 消化掉。
四、固相捕獲法
    用于去除標本中污染的核酸和雜質，原理如下：

1）、用一生物素標記的單鏈RNA 探針與待擴核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴增區(qū)；

2）、用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產物和雜質；

3）、洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA 探針雜交區(qū)域。第2）步的漂洗后可用PCR 檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。

五、RS-PCR 法（RNA-specific PCR）
    也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA 模板的特異性PCR 法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR 的敏感性。其關鍵在于設計引物，逆轉錄引物的3ˊ端（A 區(qū)）有2 0 個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0 個核苷酸（C 區(qū)）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉錄后，經超速離心使cDNA 與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR 循環(huán)中用逆轉錄引物的B 區(qū)和引物C 進行擴增加尾cDNA，而污染的DNA 或質粒DNA 才不會被擴增。

六、抗污染引物法
    該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現了擴增帶，其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物擴增，因此只要出現預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。