檢測細胞衰老的具體方法過程

        細胞衰老是細胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。眾所周知，衰老的細胞表現(xiàn)為細胞體積變大，呈扁平狀；細胞核變大，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)聚集、固縮、裂解；胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加，有空泡形成；線粒體的數(shù)目及形狀發(fā)生改變；膜流動性降低；溶酶體內(nèi)容物增多，導(dǎo)致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細胞所具有的上述特征成為各種細胞衰老檢測手段的依據(jù)。其中，對衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的檢測是有效檢測細胞衰老的經(jīng)典方法。X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）是β-半乳糖苷酶的底物，X-Gal本身無色，經(jīng)β-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生半乳糖和藍色的5-溴-4-氯-靛藍。利用X-Gal的這個特點，可以間接對β-半乳糖苷酶的活性進行測定。衰老細胞中的溶酶體內(nèi)容物通常增多，使得溶酶體酶β-半乳糖苷酶的活性升高，故可以X-Gal作為底物對細胞衰老的情況進行檢測。

1、檢測細胞衰老的具體方法過程：

（1）細胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅菌的細胞片，每孔加入1×10E5個細胞，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，使細胞在細胞片上生長。

（2）在超凈工作臺中吸棄6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入×1 PBS，洗滌細胞1次，隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室溫條件下固定3~5分鐘。

（3）吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1 PBS，洗滌細胞3次，每次3分鐘。

（4）吸棄×1 PBS，加X-Gal溶液以浸沒細胞片為宜，37℃孵育4~8小時或過夜，用保鮮膜包被6孔培養(yǎng)板以防染液蒸發(fā)。

（5）取出細胞爬片，去離子水沖洗2次，再次用固定液固定4分鐘，流水輕輕沖洗。

（6）將細胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I（2分鐘）→95%酒精Ⅱ（2分鐘）→100%酒精I（2分鐘）→100%酒精I（5分鐘）→二甲苯I（2分鐘）→二甲苯Ⅱ（2分鐘）。

（7）中性樹膠封片。

（8）在普通光學(xué)顯微鏡下觀察衰老細胞形態(tài)。

每張片子鏡下計數(shù)400個細胞，確定X-Gal染色陽性細胞（衰老細胞）在細胞群體中的所占的百分比即衰老細胞率（藍染細胞數(shù)/總計細胞數(shù)×100%）。

2、細胞衰老檢測注意事項：

①X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

②細胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈，均會影響后續(xù)的酶反應(yīng)。