細(xì)胞污染源及預(yù)防方法

       細(xì)胞污染一般可分為微生物污染和真核生物污染。其中微生物污染包括真菌和酵母、細(xì)菌、支原體等。而真核生物一般是細(xì)胞系間的交叉污染。 細(xì)胞常見的污染情況總結(jié)如下：

1、細(xì)菌污染：

細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物，其大小以微米(μm)計(jì)。常見的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。

一旦發(fā)生細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細(xì)胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結(jié)果。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。

看到這種，別猶豫了你的細(xì)胞被污染了，那么怎么辦呢，基本原則立馬扔掉，別擴(kuò)大污染，如果你的細(xì)胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復(fù)沖洗幾遍，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉su、新霉su（50ug/ml）等，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

2、真菌污染：

是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的一種，尤其在梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)易污染。污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

真菌污染真的不建議處理，因?yàn)殒咦尤菀罪h散，可能這瓶沒9過來，又?jǐn)U大了污染，建議預(yù)防為主，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅，就是藍(lán)色的那種東西。哎，如果你非救不可，可以采用兩性霉su B（0.25-2.5），三天后換液加入含PS的培養(yǎng)液。

3、支原體污染：

支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(小直徑0．2um)并生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性?？蔀閳A形、絲狀或梨形。

支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。

支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

如果懷疑細(xì)胞被支原體污染可使用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進(jìn)行處理。

4、霉菌污染

  同真菌感染一致，因?yàn)榕囵B(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染早期難以發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)為時(shí)過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，如同風(fēng)中柳絮，一般不仔細(xì)看發(fā)覺不出來。細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間一長(zhǎng)，細(xì)胞的狀態(tài)就變差，不再增長(zhǎng)。

  處理方法：建議果斷舍棄該污染細(xì)胞，將環(huán)境徹底消毒，因?yàn)槊咕念B固可能會(huì)導(dǎo)致下幾批細(xì)胞都會(huì)污染，所以，采用酒精徹底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍，把水盤里加上飽和量的硫酸銅。千萬不可大意!

5、黑膠蟲污染

  開始污染時(shí)對(duì)細(xì)胞無影響，當(dāng)數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。400倍顯微鏡下可見點(diǎn)狀或片狀游動(dòng)小體，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除換血清外無須特殊處理。

  處理方法：可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率，盡早處理細(xì)胞，越快越好。如果實(shí)在來不及了。
注意事項(xiàng)：
1、要保證實(shí)驗(yàn)室和培養(yǎng)箱的潔凈，按時(shí)殺菌，可以用酒精擦拭和紫外照射的方法。必要時(shí)可以通臭氧過夜。
2、新到的細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清都可以做一下簡(jiǎn)單的污染檢測(cè)后再開始實(shí)驗(yàn)。另外要注意每次試劑量配制不宜過多，建議分裝使用，分裝時(shí)用針頭濾器過濾一次。
3、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)一定要按照實(shí)驗(yàn)室的要求，確保無菌操作。準(zhǔn)備好細(xì)胞房專業(yè)連體潔凈衣，戴好口罩和手套。所有進(jìn)超凈臺(tái)的物品最好都用酒精擦拭一遍，超凈臺(tái)里面的東西一定要盡量少放，東西太多會(huì)影響超凈臺(tái)內(nèi)空氣流通及空氣除菌。
急救方法：
1、 判斷污染源：一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染的跡象或已污染，立即判斷可能的污染源：有無操作不當(dāng)？培養(yǎng)基、胰酶、PBS等顏色、澄清度是否正常？
2、及時(shí)處理：若確定現(xiàn)有的培養(yǎng)基、胰酶、PBS可用，則繼續(xù)使用；若無法確定則新配完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶，原有的液體在確定是否污染后再做處理。
注：若條件允許，細(xì)胞污染后zui 好的處理方式是：丟棄！??！
1 、若為霉菌污染，在以PBS潤(rùn)洗2~3遍后換液，無需加入高濃度雙抗。培養(yǎng)48h后污染未再次出現(xiàn)即可。
2 、若為真菌污染，在PBS潤(rùn)洗、換液后可加入兩性霉素B（兩性霉素B有細(xì)胞毒性，不推薦使用），也可加入300μg/mL氟康唑培養(yǎng)，污染控制后改用150μg/mL培養(yǎng)2~3代
3、 若懷疑支原體污染，則可進(jìn)行PCR檢測(cè)或直接使用支原體清除試劑。也可購(gòu)買環(huán)丙沙星注射液，于超凈臺(tái)內(nèi)打開直接添加到培養(yǎng)基中，以20μg/mL濃度2代后改用10μg/mL濃度持續(xù)培養(yǎng)約2周。
很多人把自己培養(yǎng)的細(xì)胞稱為寶寶不是沒有道理的，因?yàn)榧?xì)胞確實(shí)就是這么的脆弱，但是只要我們做好預(yù)防，用心仔細(xì)，大多數(shù)細(xì)胞污染是完全可以避免的。