PCR反應(yīng)體系靈敏度增加方法

       PCR 反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、 耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板） 五部分組成。各個組份都能影響 PCR 結(jié)果的好壞。這些組成主要分析如下：

一、緩沖液
任何一個生化反應(yīng)都必須在一定的緩沖體系中進行，緩沖體系除了提供一定的pH緩沖能力外，還有一些有助于反應(yīng)進行的成分。PCR反應(yīng)緩沖液通常采用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室溫）緩沖液體系，其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二價陽離子，一般采用Mg2+，以MgCl2的形式提供，Mg2+的濃度高低可顯著影響 PCR擴增產(chǎn)物的特異性，此外，緩沖液中還含有50 mmol/L的K+，有利于引物與模板的退火。有些緩沖液中還加入明膠或血清白蛋白（100 μg/mL）及去污劑（如Twcen20 等），對Taq DNA聚合酶起穩(wěn)定作用。
二、模板
PCR模板是含有待擴增序列的 DNA、mRNA或cDNA等，模板數(shù)量可直接影響擴增的效果。對于一般的 PCR擴增，104～107個模板分子可達到滿意的效果，一般宜用納克（ng）級的克隆DNA、微克（μg）水平的染色體DNA或102～105拷貝待擴增的DNA片段作為起始材料。除了數(shù)量外，模板的質(zhì)量也非常重要，不能有太多的蛋白質(zhì)和其他污染，特別是其他DNA的污染，即使是痕量的DNA，也會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物。
三、dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的總稱。貯備液為pH 7.0 左右，其濃度一般為20 mmol，-20℃保存。體系中為20~200 μmol即可，過低則反應(yīng)速度下降，濃度過高則特異性下降，因為dNTP能絡(luò)合溶液中的Mg2+，產(chǎn)生錯配或抑制Taq DNA聚合酶活性。
四、耐熱的DNA聚合酶
PCR反應(yīng)中使用的 DNA聚合酶必須耐高溫，在90℃以上的高溫下仍能有活性，正是由于耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用才使 PCR技術(shù)得以實現(xiàn)，目前使用的耐高溫DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。
五、引物
PCR反應(yīng)的最佳條件：
根據(jù)大量的研究報道，PCR反應(yīng)的最佳條件為：
①Taq DNA聚合酶的濃度為1.0-2.5 U/100μL反應(yīng)液；
②dNTP的濃度為20～200 μmol/L；
③Mg2+濃度為0.5～2.5 mmol/L；
④引物的濃度為0.2～1.0 μmol/L。在準備具體的PCR反應(yīng)時，還要針對模板特性、PCR儀等進行上述反應(yīng)體系的優(yōu)化，并設(shè)置試驗確定連退火溫度、延伸時間，建立其相應(yīng)的PCR反應(yīng)最優(yōu)程序。

RT-PCR實驗反應(yīng)體系增加反應(yīng)體系的靈敏度方法詳解：
1. 分離高質(zhì)量RNA：
成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。
2. 使用無RNaseH活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶：
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。
逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。
SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及thermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強得多。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長 RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。RNaseH- 的逆轉(zhuǎn)錄酶同時增加了熱穩(wěn)定性，所以反應(yīng)可以在高于正常的37-42℃的溫度下進行。在建議的合成條件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一鏈的總產(chǎn)量使用TCA沉淀法計算。全長cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類的條帶切除并計數(shù)的方法分析。
3. 提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度：
較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴增可以使用 ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，并將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進行以改善擴增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物(GSP)進行cDNA合成時(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性(cDNA熱啟動合成)。這種方法有助于防止較低溫度時所發(fā)生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度切換。
Tth熱穩(wěn)定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn2+的存在會降低忠實性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精確度的擴增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉(zhuǎn)錄效率較低，這會降低靈敏度，而且，既然單個酶就可以進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，那么沒有逆轉(zhuǎn)錄的對照反應(yīng)就不能用來將cDNA的擴增產(chǎn)物同污染的基因組DNA的擴增產(chǎn)物區(qū)分開來。
4. 促進逆轉(zhuǎn)錄的添加劑：
包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到第一鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結(jié)構(gòu)，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。為了在SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴增反應(yīng)中的濃度為0.4%，這不足以抑制PCR。
5. RNaseH處理：
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對于某些模板，據(jù)認為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會阻止擴增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。
6. 小量RNA檢測方法的提高：
當(dāng)僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量?？梢栽诩尤?font face="Calibri" style="box-sizing: border-box;">Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養(yǎng)細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。
在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的 RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時加入 BSA或RNase抑制劑。