PCR試劑盒實驗反應出問題探究

       PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應，可以選擇性擴增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈，反應完成后，將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。PCR檢測試劑盒反應失敗的原因及解決方法如下：

一 、模板質(zhì)量問題：
1、模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低?？梢耘軅€電泳看看提取的DNA，PCR陽性樣品與陰性樣品是否有明顯差別。如果確定是這種問題，可以增加模板量試試，但不一定行得通。

2、模板里面殘留某種試劑成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是這種情況，可以用試劑盒把模板再純化一下，或?qū)⒛０遄鰝€梯度稀釋以確定最佳的模板量。

3、為什么跑電泳會出現(xiàn)拖帶呢？

1）. 有可能的因為你的電壓調(diào)的太高了。電泳跟很多因素有關(guān)，其中就有一個是電壓，在適當?shù)碾妷悍秶鷥?nèi)增加是可以加快遷移速率，但是要是超到一個臨界值反而有害。你可以適當?shù)恼{(diào)低點看看。

2）.有時候發(fā)現(xiàn)上樣量太多的話會有拖帶。你看能否回收之后 ，按1:50 或1:100 等稀釋后，再當成模板擴一次怎么樣。

二 、引物問題
1）、樣品自身的基因型差異導致擴增失敗。也就是說你的引物與某些基因型的樣品結(jié)合的好，而和另一些基因型結(jié)合不好。可以換一對更保守的引物試試。祝順利！

2）、普通PCR所用的一對引物中有一個引物加多了，為正常的三倍只要引物特異性比較好，那么不會產(chǎn)生大的影響。如果恰巧是加多的這條引物不是很特異的話，也許會擴出來非特異帶。

在制備單鏈探針時候就采取這樣的不對稱pcr，沒關(guān)系的三Taq酶處于失活狀態(tài)。因為活性降低了能出現(xiàn)二聚體。

三、Taq酶處于失活狀態(tài)。因為活性降低了能出現(xiàn)二聚體。

四、模板濃度過低。

五、退火溫度過高。有可能，可以做個梯度PCR試一下。

六、循環(huán)次數(shù)過少或延伸時間過短以致目的基因擴增量不夠。這個可能性不大。

七、dNTP濃度低時PCR產(chǎn)率及特異性均增高，適合于用擴增摻入法標記生物素及放射性元素。當100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,會很影響PCR結(jié)果,即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

八、PCR產(chǎn)物電泳
1.電泳圖不清晰，可能電泳緩沖液和制膠緩沖液濃度不準或者臟了吧。換新的電泳緩沖液和制膠緩沖液試試。marker都出問題說明是膠的問題，或者電泳操作的問題。

2. PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。