免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性及定量的一項技術。IHC是一項基礎研究實驗，其總體實驗難度較低，但想要做出漂亮的染色結果卻沒有那么簡單，往往在某一個細節(jié)的疏忽會導致結果的差異較大，下面小愛為大家分析一下實驗的注意事項，希望同學們在此方面多加注意。
1、標本固定
固定的目的是為了使蛋白質凝固，減少或終止內源性/外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，保存組織或細胞內的抗原性?，F在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。有些固定劑對特殊組織有更好的效果，如苦味PLP固定液對于含糖組織保存更好，Helly固定液對于胰島和垂體效果較好等。
2、脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水，對于一些易脆的組織應減少高濃度酒精里的停留時間，透明的時間也應該控制縮短。對組織浸蠟時，一般選用56℃-58℃熔點石蠟，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。包埋時應果斷迅速，切片時注意檢查刀片是否出現缺口，防止；蠟帶出現裂痕。

3、脫蠟和水化
使組織恢復到固定后的正常狀態(tài)暴露抗原，方便與一抗結合。若脫蠟與水化不完全易出現局灶性反應和浸洗不完全，產生非特異性背景著色。
4、抗原修復
由于組織在甲醛或多聚甲醛在固定中，發(fā)生蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率，常用方法通常使用高壓加熱修復，使用高壓加熱修復對修復溫度和時間的把握十分重要，溫度越高修復時間越短，溫度與修復時間呈負相關。修復結束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復性。另外，大家盡量使用過量的抗原修復液，防止高溫液體揮發(fā)干涸，對切片造成不可逆影響。
5、標本固定
傳統(tǒng)的免疫組化法容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須對其進行滅活和封閉。滅活內源性過氧化酶一般用3%過氧化氫滅活10min左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護抗原和固定組織。
6、血清封閉
血清封閉的目的是為了一抗與組織的非特異性結合，造成假陽性，一般會采用BSA、羊血清等封閉這些位點，封閉血清一般是和二抗同一來源的，室溫封閉10-30min。
7、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間
不同的一抗?jié)舛?，孵育時間和溫度等對染色結果往往有較大的影響。在4℃下，反應緩慢，背景較淺；而37℃反應較快，時間較短；室溫介于兩者之間，二抗一般室溫孵育30min。
8、DAB顯色
檢測背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時間并不是固定的，主要方法是使用顯微鏡控制顯色時間，到出現特異性染色較強且出現背景著色較淺時就可以沖洗。如果DAB顯色時間過長（超過十分鐘）才出現陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長，也可以加入金屬離子來增強顯色（如硫酸銅、氯化鈷、硫酸鎳銨等）；如果DAB顯色時間過短顏色就很深，這可能是一抗過高，需要下調抗體濃度，如果短時間內過深
9、復染
免疫組化染色后為了襯托出組織形態(tài)結構有必要進行復染，常用試劑為Mayer’s蘇木染色，一般為2 min左右，DAB在核蛋白著色的時間可以適當縮短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返藍。
10、封片
在封片階段我們通常是用中性樹膠來進行，封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的產生從而對結果進行營影響，建議最好在通風櫥操作，這樣有利于氣泡排除干凈，不影響后續(xù)的鏡檢。