搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)分別小量和大量誘導(dǎo)菌種表達(dá)，獲得了目的蛋白的粗提物，通過(guò)Amylose親和層析獲得純化蛋白。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、 搖瓶培養(yǎng)
1)、取出4℃下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培養(yǎng)基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37℃,300r/min,恒溫振蕩培養(yǎng),過(guò)夜活化;

2)、 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100m1 2-YT培養(yǎng)基(含有Amp 100ug/ml)的500mI搖瓶中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)，作為2L搖瓶培養(yǎng)的菌種。

3)、 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含400m1 2-YT培養(yǎng)基(含有Amp 100ug/ml)的2L的搖瓶中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)。

起始誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為菌體OD600=4，誘導(dǎo)劑IPTG (IPTG貯液:濃度為20%, 0.22um膜過(guò)濾除菌，分裝后-20℃凍存。)濃度為0.03 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間控制在4h左右。

2、5L發(fā)酵罐培養(yǎng)
1)、 取出4℃下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培養(yǎng)基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)。過(guò)夜活化;

2)、 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100ml 2-YT培養(yǎng)基(含有Amp 100ug/ml)的500mI搖瓶中，37℃, 300r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)，作為5L發(fā)酵罐的菌種。

在基因工程菌株5L高密度發(fā)酵過(guò)程中，溫度由系統(tǒng)自動(dòng)控制在37℃，通過(guò)自動(dòng)流加5N氫氧化鈉和2N的鹽酸使pH保持在7左右，葡萄糖的流加采用恒速流加，即培養(yǎng)5h后開(kāi)時(shí)流加補(bǔ)料，以0.042g. (L. min)-1葡萄糖的的速率進(jìn)行補(bǔ)料。發(fā)酵的IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)均為OD600約為3時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的濃度為0.1 mg/ml。