PCR試劑盒實驗基本步驟解析

PCR（聚合酶鏈式反應）是一種分子生物學技術，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛運用于擴增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細胞內(nèi)DNA復制的條件，最終完成特定基因的體外復制。PCR實驗基本由變性、退火、延伸三個步驟完成。

1、 模板DNA的變性

模板DNA加熱到90~95℃時，雙螺旋結構的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，以便它與引物結合。變性溫度低則變性不完全，dna雙鏈會很快復性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度不能過高，變性時間應盡量縮短，以保持taqdna聚合酶的活力。PCR中DNA變性需要的溫度和時間與模板DNA的二級結構的復雜性、G-C含量高低等均有關。G-C間由三個氫鍵連接，而A-T間只有兩個氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高。對于高G-C含量的模板DNA在實驗中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環(huán)中起始階段進行熱啟動。

2、模板DNA與引物的退火

將反應混合物溫度降低至37~65℃時，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復合物，即復性。退火溫度決定PCR產(chǎn)物的特異性與產(chǎn)量。退火溫度高，特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；退火溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。退火所需要的溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般實驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的解鏈溫度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算：Ta =Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃。在反應體系中引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并且引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時，引物與模板中的互補序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多。退火時間一般為1～2min。

3、引物的延伸

DNA模板-引物復合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈。引物延伸溫度的選擇取決于DNA聚合酶的最適溫度, 一般為70～75℃。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。一般在72℃條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個堿基/秒,其速度取決于緩沖溶液的組成、ph值、鹽濃度與DNA模板的性質。

PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA擴增量可用Y＝（1＋X）n計算。

Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平（Y）均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%。反應初期，目的DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應稱平臺效應。

PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。引物如果跟原始DNA模板結合，從3'端開始擴增延伸，其產(chǎn)物的5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。引物如果是以新合成的DNA鏈（即“長產(chǎn)物片段”）為模板擴增時，模板的5'端序列是固定位置的，即新合成延伸鏈的3'端是固定的，使新合成DNA鏈的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。由于新合成的DNA鏈在下一個循環(huán)反應中可以作為引物結合擴增的模板，“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加。而原始DNA模版的量是固定的，“長產(chǎn)物片段”只按算術倍數(shù)增加，在最終PCR中的含量幾乎可以忽略不計。

一般PCR反應包括上述變性-退火-延伸三個溫度點。但在擴增某些較短目標序列（長度為100～300bp時）時，可采用二溫度點法，即把退火與延伸溫度合二為一。

4、 循環(huán)次數(shù)

PCR循環(huán)次數(shù)一般為25～40個。循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴重，復雜度增加。循環(huán)反應的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。