細(xì)胞培養(yǎng)中的污染類(lèi)型及相應(yīng)的解決辦法

細(xì)胞培養(yǎng)在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)?？寺?。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，這是克隆技術(shù)必不可少的環(huán)節(jié)，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來(lái)，所以可以說(shuō)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的生物污染包括細(xì)菌污染、霉菌污染、支原體污染、黑點(diǎn)污染、真菌污染和原生動(dòng)物污染。這些污染在細(xì)胞培養(yǎng)中的特點(diǎn)及相應(yīng)的解決辦法如下：

1.細(xì)菌污染

細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下呈黑色和細(xì)砂狀。根據(jù)感染菌的種類(lèi)不同，可能會(huì)呈現(xiàn)不同的形狀，培養(yǎng)液一般會(huì)變得渾濁、黃色，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯影響。

解決方法：

仔細(xì)檢查器具的滅菌情況，確保通風(fēng)時(shí)間和高壓滅菌器的壓力是否足夠。最重要的是，與培養(yǎng)基接觸的移液管等物品如果被污染兩次，則可能會(huì)導(dǎo)致儲(chǔ)存溶液也受到污染。所以一定要注意！下次使用前要檢查培養(yǎng)基的渾濁度。此外，建議在培養(yǎng)基中添加抗生素。

2.霉菌污染

正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無(wú)雜質(zhì)。一旦出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見(jiàn)絲狀和團(tuán)塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時(shí)，雖然細(xì)胞仍在生長(zhǎng)，但它們的生命狀態(tài)會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間后逐漸惡化。

解決方法：

用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養(yǎng)箱，向托盤(pán)中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時(shí)轉(zhuǎn)移所有細(xì)胞，并立即徹底使用 guo 氧乙酸溶液擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。將 guo 氧乙酸放在培養(yǎng)箱中一小時(shí)，使蒸汽擴(kuò)散，待 guo 氧乙酸氣味消散后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每?jī)蓚€(gè)月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 兩性霉素、霉素抑制素、fang 線菌素 D 或青霉素鏈霉素。一旦被污染，就不可能恢復(fù)，即使使用上述抗生素，也沒(méi)有什么區(qū)別。對(duì)于支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)，最好選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無(wú)支原體的儲(chǔ)存液，徹底消毒環(huán)境。如果所有的細(xì)胞都被污染了，那可能是整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。因此，必須對(duì)培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行檢查。如果只是個(gè)別污染，可能是操作問(wèn)題，有必要注意實(shí)驗(yàn)操作步驟的規(guī)范。

3.支原體污染

支原體是隱蔽的污染物，不能通過(guò)過(guò)濾去除。顯微鏡下沒(méi)有任何可見(jiàn)的支原體污染跡象，比如細(xì)胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴(yán)重污染的培養(yǎng)基中），這樣就會(huì)導(dǎo)致我們產(chǎn)生錯(cuò)誤的安全感。而在牛血清中，支原體是最常見(jiàn)的微生物之一。

解決方法：

通常的過(guò)濾滅菌方法對(duì)支原體沒(méi)有影響。細(xì)胞一旦被支原體污染，特別是對(duì)重要的細(xì)胞系，必須去除支原體，一般的方法有抗生素治療、抗血清治療和抗血清與補(bǔ)體聯(lián)合治療。值得注意的是，支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒(méi)有細(xì)胞壁。因此，它對(duì)作用于細(xì)胞壁的生物合成抗生素（如 β-內(nèi)酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等）完全不敏感，并且通常對(duì)多粘菌素、利福平和磺胺類(lèi)藥物具有耐藥性。相反，四環(huán)素類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)支原體的抑制作用最強(qiáng)，而氨基糖苷類(lèi)和氯霉素的抑制作用較弱。

4.黑點(diǎn)污染

黑色的游動(dòng)點(diǎn)能穿透濾膜并在空氣中擴(kuò)散。它們?cè)诘捅剁R下顯示為黑色圓點(diǎn)，在高倍鏡下顯示為可移動(dòng)的黑色斑點(diǎn)。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細(xì)胞仍可使用。通常，黑點(diǎn)污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，運(yùn)動(dòng)物體無(wú)明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無(wú)明顯變化。在同一批血清培養(yǎng)的細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象。

解決方法：

黑點(diǎn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有明顯影響，細(xì)胞增殖后會(huì)自然消失，因此除了血清置換外，無(wú)需特殊處理。如果細(xì)胞可能被小的運(yùn)動(dòng)點(diǎn)污染，建議增加培養(yǎng)皿細(xì)胞密度，以提高細(xì)胞存活率。

5.真菌污染

真菌污染后，培養(yǎng)基一般清澈，保持原色。細(xì)絲可以在顯微鏡下觀察到。最初，一些真菌類(lèi)似于死細(xì)胞碎片，但其中許多清晰可見(jiàn)，看起來(lái)像珊瑚，比較容易區(qū)分。此外，它們會(huì)慢慢長(zhǎng)出細(xì)細(xì)的黑色細(xì)絲，因?yàn)樗鼈兩L(zhǎng)得比較慢，不像細(xì)菌那樣容易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基被污染，它們將很難存活。

解決方法：

一旦被真菌污染，果斷丟棄，然后對(duì)細(xì)胞房、CO2 培養(yǎng)箱、器皿和培養(yǎng)基進(jìn)行徹底消毒。

6.原生動(dòng)物污染

原生動(dòng)物污染后，細(xì)胞培養(yǎng)基變得輕微渾濁。在顯微鏡下，大量的小點(diǎn)來(lái)回移動(dòng)。雖然此時(shí)細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，但繁殖速度減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，邊緣不清，變得不透明。原生動(dòng)物與細(xì)胞形成共生關(guān)系。同時(shí)，原生動(dòng)物與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)。這種共生現(xiàn)象非常普遍，但以細(xì)胞為主，因?yàn)樵鷦?dòng)物的數(shù)量相對(duì)較少，因而對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)沒(méi)有影響，只有當(dāng)它們達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，才最終爆發(fā)成為惡性循環(huán)。

解決方法：

原生動(dòng)物污染的原因有很多，如液體消毒問(wèn)題、操作問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題等，如果細(xì)胞足夠，果斷丟棄被污染的細(xì)胞和復(fù)蘇細(xì)胞。如果要保留，需要購(gòu)買(mǎi)使用相關(guān)的滅菌試劑。

 另外，污染的可能原因很多，

比如配液消毒問(wèn)題、操作問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題等等。

關(guān)于培養(yǎng)基的無(wú)菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37度試培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察。如果沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)就是操作的問(wèn)題。

也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時(shí)會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測(cè)細(xì)胞某項(xiàng)指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

避免污染辦法：

1、孵箱應(yīng)定期用三氧機(jī)消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時(shí)孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水。

2、超凈臺(tái)\取材\器材\培養(yǎng)液\培養(yǎng)瓶\操作等因素。

3、超凈臺(tái)的風(fēng)機(jī)不能過(guò)大，風(fēng)機(jī)到6-8格。否則也可能能致霉菌污染。

4、無(wú)菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時(shí)即可進(jìn)入操作。