探究PCR引物的必要性

PCR引物的必要性：

1、 pcr技術(shù)的基本原理類(lèi)似于dna的自然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

2、pcr是一種體外dna擴(kuò)增技術(shù)，它依賴(lài)于dna聚合酶在模板dna、引物和四種脫氧核苷酸存在下的酶促反應(yīng)。待擴(kuò)增的DNA片段及其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物通過(guò)“高溫變性-低溫退火-引物延伸”三步反復(fù)循環(huán)，使DNA片段的數(shù)量成倍增加，因此在短時(shí)間內(nèi)，我們需要大量的特異性基因片段。

3、dna聚合酶無(wú)法從頭合成與模板鏈匹配的新鏈，只能在模板鏈上以一段短?。ㄒ话銕譩p至十幾bp不等）但與模板鏈配對(duì)緊密的鏈作為起始鏈，沿5->3方向合成新鏈，這個(gè)過(guò)程我們稱(chēng)之為“延伸”。

4、起始鏈的合成在真核細(xì)胞體內(nèi)是由rna聚合酶（對(duì)就是轉(zhuǎn)錄時(shí)用的那個(gè)）代勞的，此酶具有從頭合成鏈的能力（即“起始”能力）之后dna合酶以這段短的rna鏈為起始，不斷延伸合成新鏈。這段短rna鏈起到了“引發(fā)”新鏈合成的功能，因此也被稱(chēng)作“引物”。在原核生物中，dna分子以環(huán)狀形式存在，隨便切個(gè)口就可以以切口3端作為起始開(kāi)始延伸了 （當(dāng)然人家細(xì)菌還是有操守的，為了切得方便還是門(mén)設(shè)置了一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)）。

5、在dna新鏈延伸完畢后，真核細(xì)胞需要將作為起始鏈的rna鏈替換為dna，這個(gè)過(guò)程依據(jù)位置不同在細(xì)胞里大致有兩種處理方式：如果引物在dna鏈一端，別說(shuō)了直接上端粒合酶吧；若引物位于dna鏈中間，則是由同樣具有dna延伸活性（但速度比述的dna合酶慢許多）并兼具5->3方向水解能力（這樣才能把引物rna鏈切掉）的另一種dna合酶代勞，后用dna連接酶將替換鏈和新鏈之間的小缺口填補(bǔ)上。原核生物等低等生物中由于有滾環(huán)復(fù)制θ復(fù)制等特殊機(jī)制存在，復(fù)制流程的細(xì)節(jié)上會(huì)有差異，并且會(huì)多一步切割并環(huán)化dna分子的步驟，不過(guò)總體機(jī)制大同小異。

可見(jiàn)，在生物體內(nèi)的dna復(fù)制過(guò)程是復(fù)雜的，需要多種酶先后參與進(jìn)來(lái)，并且對(duì)于dna的延伸來(lái)說(shuō)，引物是必不可少的。

6、在體外的pcr體系中，由于：

①出于成本考量，暫時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化在pcr工作溫度（55°C－－95°C+）下仍具有很好活性的rna合酶、dna合酶（替換引物用）、dna鏈接酶。

②出于現(xiàn)有工藝考量，從頭合成設(shè)計(jì)好的dna短引物是相對(duì)簡(jiǎn)單快捷的技術(shù)，并且可以省略引物的替換步驟。

因此使用短dna作為引物是必要且高效的選擇。