AKP活性分光光度法試劑盒測(cè)定操作

測(cè)定原理：

在堿性條件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍(lán)；鎢藍(lán)在680nm有特征吸收峰，測(cè)定680nm吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算AKP活性。

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

堿性蛋白酶（AKP）是指在堿性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的酶類，屬于絲氨酸蛋白酶。此外，該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵，具有轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一，廣泛應(yīng)用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。

試劑組成和配制：

試劑一：液體90mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加10 mL蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入20 mL試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱15-30分鐘，該試劑為過(guò)飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。

試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加50 mL蒸餾水溶解。

試劑五：液體10mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到680 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二、試劑三和試劑四置于40℃水浴保溫30min。

3. 對(duì)照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL試劑二，混勻后置于40℃水浴保溫10min；加入200μL試劑三，混勻后8000g ，4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A對(duì)照管。

4. 測(cè)定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min；加入200μL試劑二，混勻后8000g ，4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。（注意與對(duì)照管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5. 空白管：取一支EP管，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑四200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A空白管。

6．標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。