RNA的提取具體步驟

      RNA提取原理用Trizol 的溶液提取，將總RNA與 DNA 和蛋白質(zhì)分離。Trizol 是一種酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白質(zhì)和 RNase 變性。隨后進(jìn)行離心。在酸性條件下，總 RNA 保留在上層水相中，而大部分 DNA 和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機(jī)相中。然后通過(guò)用異丙醇沉淀回收總 RNA。RNase 酶可以通過(guò)加入吡咯碳酸二乙酯 (DEPC) 來(lái)滅活。

RNA的提取具體步驟：

1、從液氮中取出組織后，快速的拿到超凈臺(tái)上，放入小皿中，加入trizol試劑，（100mg的組織放入1.2ml的trizol試劑），用注射器進(jìn)行研磨，注意要熟練，快速研磨。（下面加的試劑按照1ml trizol的比例添加即可）。
2、細(xì)胞或組織加入Trizol研磨后，15~30℃孵育15min，使其充分裂解。(此時(shí)如果不接著做下面的實(shí)驗(yàn)可以凍存于-80℃低溫冰箱)。
3、4℃，12000轉(zhuǎn)，離心5min ,棄沉淀。（超凈臺(tái)準(zhǔn)備好EP管，離心后，吸取上清至準(zhǔn)備好的EP管中）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，劇烈振蕩15s,（用手震蕩即可）15~30℃孵育2~3min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。（氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般儲(chǔ)存在4℃冰箱中）。
4、4℃，12000轉(zhuǎn),離心15min。吸取上層水相，至另一離心管中。注：（1）吸取水相要小心，千萬(wàn)不要吸取中間界面?？刹捎眯岊^少量多次吸?。?）若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保存下層有機(jī)相，存于4℃冰箱內(nèi)備用，否則棄下層有機(jī)相。
5、按500ul異丙醇/ml Trizol 的比例加入異丙醇，用手震蕩一下，15~30℃（室溫即可）孵育10min。2~8℃，12000g,離心10min,棄上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇／ml Trizol加入75％乙醇，漩渦混勻，懸浮沉淀。（注：75％乙醇用DEPC水配制）
6、4℃，7500轉(zhuǎn)離心5min，盡量棄盡上清（注：用完離心機(jī)關(guān)電源后，將離心機(jī)蓋打開(kāi)30分鐘降溫，再蓋上）室溫晾干或真空干燥5~10min。（注：不能用離心的方法使RNA干燥，RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。）
7、1×RNAsafe30 ul（或1‰DEPC水30ul）溶解RNA沉淀,60℃水浴20min（注：用蒸餾水配置1/100的DEPC水高壓后才能用,20×RNAsafe 用DEPC水稀釋）測(cè)OD值定量RNA濃度（用DU800紫外光度計(jì)測(cè)量）如果提取的RNA不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄可在-80℃保存。